一种基于杂交链式反应的SARS

作者：杨超月

一种基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系及检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系及检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术：

2.新型冠状病毒感染症(covid-19)在全球范围内迅速蔓延，对公共卫生造成严重威胁，对人们的日常生活产生重大影响。它是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)感染引起的，sars-cov-2是属于冠状病毒科的单链rna病毒，主要传播途径为呼吸道飞沫和接触传播。及时、准确地发现病毒是控制疫情和早治疗感染病例的关键。虽然实时定量逆转录聚合酶链反应(rt-qpcr)是最常见的检测sars-cov-2的方法，但由于其需要将病毒rna通过逆转录酶转化为互补dna(cdna)，且周转时间较长，因此需要进一步开发替代的检测分析技术。此外，由污染引物二聚产生的假阳性结果或由dna聚合酶失活产生的假阴性结果也会影响检测的可靠性。对专业设备、专有试剂和受过培训的人员的需求会进一步限制该方法的推广。
3.由于qpcr设备的使用受限，降低了诊断效率，为大规模测试中巨大的检测需求带来了压力。一个主要的问题是尽量降低对精确温度变化和实时监测所必需的设备的要求。近年来，基于等温dna扩增的新冠病毒核酸检测方法被设计出来，如环介导等温扩增(lamp)，其产生的茎环dna有多个反向重复的目标和crispr/cas系统，其结合靶区后导致dna裂解。信号输出多为荧光信号，如荧光强度、最大荧光阈值时间或荧光极性等。为了使输出信号更容易测量以及可视化，最近开发了比色测定方法，如怀孕试验条带上的lamp介导染色和crispr/cas12a介导的纳米颗粒聚集。在这类检测方法中蛋白质酶是必需的，例如lamp中的dna聚合酶或crispr中的cas12a蛋白，因此它有酶失活的风险，需要更严格的反应条件。而某些酶对dna的专一作用，靶rna片段在大多数情况下仍需逆转录。此外，低聚核苷酸需要用官能团进行标记，需要繁琐的修饰步骤，例如，将胺化dna与人绒毛膜促性腺激素结合，或将硫代dna修饰到纳米颗粒上，需要几天的制备时间。在一定程度上，使操作更加复杂，延迟了检测时间，增加了检测成本。

技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系及检测方法。
5.一种基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系，包括连接器、杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、纳米金粒子和盐溶液；
6.所述连接器的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7.所述杂交链式反应发夹探针1的核苷酸序列如seq id no.2所示；
8.所述杂交链式反应发夹探针2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9.根据本发明优选的，所述纳米金粒子的制备方法如下：
10.配制浓度为38.8mm的柠檬酸钠水溶液，配制浓度为1mm的haucl4水溶液；将haucl4水溶液加热至沸腾，然后一边搅拌一边将柠檬酸钠水溶液加入至haucl4水溶液中，在加热沸腾状态下，反应10min，反应完成后再搅拌15min，冷却至25℃，过滤，得到纳米金粒子(aunps)。
11.根据本发明优选的，所述盐溶液为nacl溶液。
12.一种sars-cov-2检测试剂盒，所述试剂盒包括上述基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系。
13.根据本发明优选的，所述试剂盒中连接器的工作液浓度为100nm，杂交链式反应发夹探针1的工作液浓度为400nm、杂交链式反应发夹探针2的工作液浓度为400nm、纳米金粒子的工作浓度为3nm，盐溶液的工作浓度为50nm。
14.根据本发明优选的，所述工作液的溶剂为hepes缓冲液，所述hepes缓冲液的浓度为10mm。
15.利用上述检测体系或检测试剂盒检测sars-cov-2的方法，包括步骤如下：
16.(1)将杂交链式反应发夹探针1和杂交链式反应发夹探针2在95℃下加热2min，得到退火后的杂交链式反应发夹探针1和杂交链式反应发夹探针2；
17.(2)将退火后的杂交链式反应发夹探针1、杂交链式反应发夹探针2、连接器和待测样本混合，在37℃下孵育3h；然后将孵育后的混合物加入到纳米金粒子溶液中，在37℃下孵育3～8min，继续加入盐溶液，当孵育液显示紫色，则待测样本中包含sars-cov-2。
18.根据本发明优选的，步骤(2)中，所述孵育后的混合物和纳米金粒子溶液的体积比为1：11。
19.在本发明中，杂交链式反应发夹探针1简称为h1，杂交链式反应发夹探针2简称h2。
20.本发明检测sars-cov-2的技术原理如下：
21.如图1所示，本技术发明人从sars-cov-2病毒基因组开放阅读框和核衣壳选择两个rna基因片段orf1ab和n，核苷酸序列分别如seq id no.4所示和seq id no.5所示。然后根据这两个基因片段设计了连接器connector(seq id no.1)、h1(seq id no.2)和h2(seq id no.3)。连接器connector与orf1ab的3'端结构域和n的5'端结构域杂交，诱导产生dna三联体，orf1ab的5'端结构域和n的3'端结构域保持未杂化，它们结合在一起形成一个暴露区域，作为一个检测立足点。h1的单链尾部和部分茎部区域与立足点互补。当通过立足点进攻dna三联体时，h1和h2之间的杂交链式反应(hcr)被触发，两个发夹交替打开，产生有缺口的双螺旋长链。由于嵌入的碱基和宏观链的长度，生成的hcr产物对未修饰的纳米金粒子(aunps)表现出较弱的亲和力，dna螺旋长链不能吸附到aunps上并提供保护，在高盐浓度下不能稳定纳米金粒子，导致纳米粒子在高盐浓度下聚集发生颜色变化。因此，当orf1ab和n同时存在时，可以观察到颜色转变为紫色。仅orf1ab或n存在时不能形成位点来触发hcr扩增，大量的h1和h2通过尾部的锻炼吸附到aunps上，保护aunps不受盐诱导的聚集，并保持溶液红色，从而可以根据溶液颜色来判断待测样本中是否包含sars-cov-2。
22.本发明的有益效果如下：
23.1、本发明提供了一种基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系，以dna三联体为识别导向，结合杂交链反应，设计连接器和杂交链式反应发夹探针，利用杂交链反应产物和纳米金粒子亲和力较弱的特性，实现了可视化的sars-cov-2检测，并且本发明的检测体系
具有干扰因素少、价格便宜和稳定性好的优点。
24.2、本发明提供的检测方法选择性良好，灵敏度高，在缺少任何一个序列的情况下，颜色不会改变，能以单核苷酸特异性区分目标序列。利用本发明的体系或试剂盒进行检测时，不需要逆转录步骤，避免了酶、标记或修饰的使用，结果可视化，减少了对复杂设备的需求，为sars-cov-2病毒检测提供一种方便、经济、快速、可靠的方法。
附图说明
25.图1为本发明杂交链式反应可视化检测核酸标志物的原理示意图。
26.图2为天然聚丙烯酰胺凝胶电泳验证dna三联体的形成结果图。
27.泳道m：500bp dna标记；泳道1：orf1ab序列；泳道2：n序列；泳道3：connector序列；泳道4：orf1ab+n+connector。
28.图3为琼脂糖凝胶电泳对h1/h2的最佳茎长与立足点触发杂交链反应的研究结果图。
29.泳道1、2：茎长为13个碱基对的h1/h2发夹；泳道3、4：茎长为15个碱基对的h1/h2；泳道5、6：茎长为17个碱基对的h1/h2发夹。泳道7：50bp dna ladder。
30.图4为用琼脂糖凝胶电泳法对最佳hcr反应时间的研究结果图。
31.泳道1：h1+h2；泳道2到5：hcr反应时间分别为1h、2h、3h和4h；泳道6：50bp dna ladder。
32.图5为aunps的紫外-可见吸收光谱(a)、透射电子显微镜图像(b)和aunp溶液的照片(c)。
33.图6为本发明检测体系在检测浓度为33nm的sars-cov-2病毒基因片段和浓度为0nm的sars-cov-2病毒基因片段的紫外-可见吸收光谱(a)、动态光散射表征(b)和aunp溶液的颜色变化照片(c)。
34.图7为本发明检测体系在检测梯度浓度为0、20/3、40/3、20、80/3、33nm的sars-cov-2病毒的紫外-可见吸收光谱图(a)、紫外吸收比与病毒双基因片段浓度的关系图(b)和可视化溶液颜色变化图(c)。
35.图8为杂交链式反应的反应产物随orf1ab和n浓度增加的变化规律的研究结果图。
36.泳道1：h1+h2+0.25
×
connector；泳道2：h1+h2+0.25
×
connector+0.15
×
(orf1ab+n)；泳道3：h1+h2+0.25
×
connector+0.20
×
(orf1ab+n)；泳道4：h1+h2+0.25
×
connector+0.25
×
(orf1ab+n)；泳道5：50bp dna ladder。
37.图9为无sars-cov-2病毒基因片段、单orf1ab或n的sars-cov-2病毒基因片段、sars-cov-2病毒基因片段的可视化观察结果图(a)和orf1ab序列单碱基突变的可视化观察结果图(b)。
38.图中，0为不含有orf1ab或n，1为含有orf1ab或n。
39.图10为本发明检测体系在检测无sars-cov-2病毒基因片段、单orf1ab或n的sars-cov-2病毒基因片段、sars-cov-2病毒基因片段紫外-可见吸收光谱图。
40.图11为通过琼脂糖凝胶电泳方法对病毒基因片段的不同存在情况引发hcr反应的研究结果图。
41.泳道1：h1+h2+0.25
×
connector；泳道2：h1+h2+0.25
×
(connector+orf1ab)；泳道
3：h1+h2+0.25
×
(connector+n)；泳道4：h1+h2+0.25
×
(connector+orf1ab+n)；泳道5：50bp dna ladder。
具体实施方式
42.下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
43.凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
44.试剂和原料
45.dna序列(表s1)由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)合成和纯化。
46.琼脂糖和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)购自阿拉丁生化科技有限公司(上海，中国)。
47.40％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(19：1)溶液，过硫酸铵(aps)，n，n，n'，n'-四甲基乙二胺(temed)，tris，乙二胺四乙酸四钠(edta)，购自生工生物工程股份有限公司(上海，中国)。
48.sybr gold核酸凝胶染料购自赛默飞世尔科技公司。
49.四氯金酸氢(ⅲ)三水合物(haucl4·
3h2o)和柠檬酸钠购自sigma-aldrich公司(密苏里州，美国)。
50.所有其他试剂均为分析纯，按原样使用。在整个实验过程中，使用了从up水净化系统获得的超纯水(18.25mω
·
cm)。
51.500bp dna marker购自生工生物工程股份有限公司(上海，中国)。
52.50bp dna ladder购自宝日生物医学技术有限公司(北京)。
53.tu-1901光谱仪(普析，中国)记录紫外可见吸收光谱。染色的聚丙烯酰胺凝胶在geldoctm xr
+
成像系统(bio-rad laboratories inc.，美国)上成像。在纳米粒度电位仪(malvern，英国)上进行了动态光散射(dls)测量。透射电子显微镜(tem)测量在加速电压为200kv的jsm-6700f透射电子显微镜上进行(jeol,日本)。其它如无特殊说明，均可从商业途径获得。
54.表1.实施例中使用的寡核苷酸序列
[0055][0056]
表1中，在orf1ab和n序列中斜体标记的碱基代表协同立足点的两个部分。orf1ab和connector序列之间的互补碱基为宋体小四，n和connector序列之间的互补碱基用粗体标记。上标13、15和17分别代表不同茎长的h1和h2发夹，茎部分用下标标注。orf1ab中不匹配的碱基用粗体标记。orf1ab中被删除的碱基用短划线标记。orf1ab中插入的碱基用粗体标记，原始碱基用粗体标记。
[0057]
实施例1
[0058]
本发明根据ncbi数据库已经公开的sars-cov-2病毒基因组信息(ncbi参考序列：nc_045512.2)，从开放阅读框和核衣壳选择两个rna基因片段orf1ab(seq id no.4)和n(seq id no.5)，然后根据这两个基因片段设计了连接器connector，引发序列initiator和三组杂交链式反应发夹探针，分别为h1
13
和h2
13
、h1
15
和h2
15
、h1
17
和h2
17
，具体序列如表1所示。然后由生工生物工程股份有限公司(上海，中国)合成和纯化。
[0059]
实施例2验证dna三联体的形成
[0060]
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0061]
通过混合6.25ml 40％的丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液(19:1)，5ml 1
×
tbe缓冲液(89mm tris，89mm硼酸，2mm edta，ph 8.0)，13.75ml的超纯水，180μl 0.1g/ml aps和18μl temed制备10％聚丙烯酰胺凝胶。取orf1ab序列、n序列、connector序列和orf1ab+n+
connector序列各6μl，分别与4μl hepes缓冲液(10mm hepes,300mm nacl,ph 7.0)和2μl 6
×
loading buffer混合，将2μl的混合液注入凝胶孔中。凝胶在1
×
tbe缓冲液中，在4℃，150v下的条件下运行5h，用1
×
sybr gold染色30min后，用成像系统成像，结果如图2所示。
[0062]
由图2可知，连接器connector与orf1ab的3'端结构域和n的5'端结构域杂交，诱导产生dna三联体。
[0063]
实施例3
[0064]
1、dna与rna溶液的制备与储存
[0065]
在te缓冲液(10mm tris-hcl，1mm edta，ph 8.0)中制备表1中所述序列的浓缩dna原液，用hepes缓冲液(10mm hepes，300mm nacl，ph 7.0)稀释至工作液浓度。
[0066]
浓缩方法：将核酸序列溶于管上所标识微升数的te缓冲溶液中，用紫外吸收光谱法测定浓缩液浓度。
[0067]
将h1
13
和h2
13
、h1
15
和h2
15
、h1
17
和h2
17
在95℃下加热2min，缓慢冷却至室温。将退火后的h1
13
和h2
13
、h1
15
和h2
15
、h1
17
和h2
17
保存在4℃备用。
[0068]
2、h1和h2的选择
[0069]
将浓度为400nm的h1
13
和h2
13
、h1
15
和h2
15
、h1
17
和h2
17
在hepes缓冲液中分别与浓度为100nm的连接器connector、浓度为100nm的orf1ab、浓度为100nm的n混合，在37℃的条件下反应3h，形成了dna三联体触发的聚合反应，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
[0070]
由图3可知，茎长为13个碱基对的h1/h2发夹在没有和存在dna三联体的情况下均可聚合；茎长为15个碱基对的h1/h2发夹在没有dna三复合体时不杂交，而在有dna三复合体时聚合；茎长为17个碱基对的h1/h2发夹在没有dna三联体的情况下不杂交，在有dna三联体的情况下很少聚合。因此选择h1
15
和h2
15
作为发夹探针，以下实施例中h1和h2均指h1
15
和h2
15
。
[0071]
3、最佳反应时间的确定
[0072]
将浓度为400nm的退火后h
15
和h2
15
与浓度为100nm的连接器connector、浓度为100nm的orf1ab、浓度为100nm的n在hepes缓冲液中混合，在37℃的条件下孵育1h、2h、3h和4h，然后将孵育产物进行琼脂糖凝胶，结果如图4所示。
[0073]
由图4可知，最佳反应时间为3h。
[0074]
实施例4
[0075]
1、纳米金粒子的制备方法如下：
[0076]
配制10ml浓度为38.8mm的柠檬酸钠水溶液，配制100ml浓度为1mm的haucl4水溶液；将haucl4水溶液加热至沸腾，然后一边剧烈搅拌一边将柠檬酸钠水溶液快速加入至haucl4水溶液中，在加热沸腾状态下，反应10min，反应完成后再搅拌15min，冷却至25℃，通过0.22μm过滤器过滤，得到纳米金粒子(aunps)。
[0077]
2、透射电子显微镜表征
[0078]
在碳包覆铜栅上加入一滴纳米金粒子溶液，室温干燥，制备用于tem表征的样品。在加速电压为200kv的jsm-6700f透射电子显微镜上进行表征。
[0079]
本实施例aunps的紫外-可见吸收光谱如图5a所示，透射电子显微镜(tem)图像如图5b所示，aunp溶液的照片如图5c所示。
[0080]
由图5a、图5b和图5c可知，aunps合成成功，aunps溶液颜色为红色。
[0081]
实施例5
[0082]
一种基于杂交链式反应的sars-cov-2检测体系或检测试剂盒，包括连接器connector、杂交链式反应发夹探针1(h1)、杂交链式反应发夹探针2(h2)、aunps和nacl溶液。
[0083]
所述连接器connector的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述h1的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述h2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0084]
所述连接器connector的工作液浓度为100nm，h1的工作液浓度为400nm、h2的工作液浓度为400nm、aunps的工作浓度为3nm，nacl溶液的工作浓度为50nm。
[0085]
利用sars-cov-2检测体系或检测试剂盒检测sars-cov-2的方法，包括步骤如下：
[0086]
(1)将h1和h2在95℃下加热2min，得到退火后的h1和h2；
[0087]
(2)将退火后的h1、h2、连接器connector和待测样本混合，在37℃下孵育3h；然后将孵育后的4μl混合物加入到44μl的aunps溶液中，在37℃下孵育5min，继续加入5.34μl的nacl溶液，当孵育液显示紫色，则待测样本中包含sars-cov-2。
[0088]
分别以浓度为33nm的sars-cov-2病毒基因片段和浓度为0nm的sars-cov-2病毒基因片段作为待测样本，按照上述方法进行检测，并对最终反应液进行动态光散射表征，结果如图6所示。
[0089]
动态光散射表征方法如下：将50μl的反应液加入到50μl的一次性比色皿(sarstedt，德国)中，在纳米粒度电位仪上进行了动态光散射表征，并测量。
[0090]
由图6可知，浓度为33nm的sars-cov-2病毒基因片段在550～700nm处的吸光度明显高于浓度为0nm的sars-cov-2病毒基因片段(图6a)，浓度为33nm的sars-cov-2病毒基因片段和浓度为0nm的sars-cov-2病毒基因片段的动态光散射表征相比说明了在加入sars-cov-2病毒后aunps有明显的聚集(图6b)，浓度为33nm的sars-cov-2病毒基因片段的反应液颜色为紫色(+)，浓度为0nm的sars-cov-2病毒基因片段的反应液颜色为红色(-)(图6c)。
[0091]
分别以梯度浓度为0、20/3、40/3、20、80/3、33nm的sars-cov-2病毒作为待测样本，按照上述方法进行检测，检测结果如图7所示。
[0092]
由图7可知，本发明检测体系的检测线为2nm。
[0093]
实施例6
[0094]
1、将h1、h2、connector、orf1ab和n分别按照以下浓度进行杂交链式反应，反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示。
[0095]
①
400nm h1+400nm h2+100nm connector；
[0096]
②
400nm h1+400nm h2+100nm connector+60nm orf1ab+60nm n；
[0097]
③
400nm h1+400nm h2+100nm connector+80nm orf1ab+80nm n；
[0098]
④
400nm h1+400nm h2+100nm connector+100nm orf1ab+100nm n；
[0099]
由图8可知，当orf1ab和n浓度和connector为1：1的时候，h1和h2被完全反应。
[0100]
2、将h1、h2、connector、orf1ab和n分别按照以下浓度进行杂交链式反应，反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示。
[0101]
①
400nm h1+400nm h2+100nm connector；
[0102]
②
400nm h1+400nm h2+100nm connector+100nm orf1ab；
[0103]
③
400nm h1+400nm h2+100nm connector+100nm n；
[0104]
④
400nm h1+400nm h2+100nm connector+100nm orf1ab+100nm n；
[0105]
由图11可知，在orf1ab和n双靶标核酸序列的存在下，hcr反应才能被触发。
[0106]
实施例7
[0107]
1、分别以无sars-cov-2病毒基因片段(sars-cov-2病毒浓度为0nm)、仅含orf1ab的sars-cov-2病毒基因片段(浓度为33nm)、仅含n的sars-cov-2病毒基因片段(浓度为33nm)和sars-cov-2病毒基因片段(浓度为33nm)作为待测样本，按照实施例5所述方法进行检测，检测结果如图9a，其反应液进行紫外-可见吸收光谱图如图10所示。
[0108]
由图9a可知，本发明的检测体系对含有orf1ab+n的sars-cov-2病毒基因片段具有特异性，只有orf1ab+n时，反应液显示紫色，无orf1ab或n、仅含有orf1ab或n，均显示红色。图10进一步说明了单个靶标核酸序列orf1ab或n不能引起变色。
[0109]
2、分别以orf1ab发生碱基错配的sars-cov-2病毒基因片段(orf1ab-mismatched，表1，浓度为33nm)、orf1ab发生碱基缺失的sars-cov-2病毒基因片段(orf1ab-deleted，表1，浓度为33nm)、orf1ab发生碱基插入的sars-cov-2病毒基因片段(orf1ab-inserted，表1，浓度为33nm)和sars-cov-2病毒基因片段(matched，浓度为33nm)作为待测样本，按照上实施例5所述方法进行检测，检测结果如图9b所示。
[0110]
由图9b可知，orf1ab序列发生碱基错配、缺失和插入的sars-cov-2病毒基因片段也均显示红色，sars-cov-2病毒基因片段显示紫色。说明单个靶标核酸序列orf1ab发生碱基错配、缺失和插入后也不能引起变色，保证了检测准确率。