1α对坏死性小肠结肠炎小鼠脑损伤的保护作用

作者：杨超月

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是早产儿常见的严重胃肠道疾病之一，其特征是伴有不同程度出血、坏死的全肠道炎症。NEC在极低出生体质量(<1 500 g)出生儿中发病率为7%[]，其病死率高达30%~50%[]。NEC幸存儿常患有多种短期和长期并发症，不仅包括短肠综合征、肠道狭窄等肠道疾病，还会导致神经发育障碍[]。研究报道，与未患NEC的同年龄早产儿相比，约45%的NEC患儿存在神经发育障碍[]。一些使用大脑核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)研究显示，NEC患儿出现了髓鞘发育受损、脑容量减少的病理改变[-]。在NEC动物模型研究中发现，NEC小鼠脑中小胶质细胞由TLR通路激活，导致少突胶质细胞减少，髓鞘发育异常[]。目前，关于NEC对大脑损伤的研究比较局限，其导致脑损伤的具体机制仍有待探索，且临床上尚缺乏针对NEC患儿神经保护的措施。

缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被认为是机体在应激条件下起关键作用的转录因子，在机体炎症的发生、氧化应激、细胞凋亡等多个过程中都发挥着作用[]，且与NEC的病理过程中的炎症反应、缺血缺氧密切相关。一项临床试验发现，NEC患儿肠道HIF-1α表达明显升高[]。在NEC小鼠模型中，肠道HIF-1α表达同样升高，并且进一步激活其表达可以提高NEC小鼠的生存率，减轻NEC肠道炎症[]。在新生大鼠缺血缺氧性脑病中，HIF-1α高表达可改善脑部缺血，具有神经保护作用[]。但目前缺乏有关HIF-1α是否能对NEC脑损伤产生神经保护的作用的相关研究。因此，本研究采用经典NEC小鼠模型，检测小鼠脑中少突胶质细胞的数量及神经炎症的情况，以期模拟临床NEC患儿脑损伤状况，并加以HIF-1α稳定剂和抑制剂干预，探讨HIF-1α在NEC脑损伤中的作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物

5日龄C57BL/6小鼠81只，购自重庆医科大学动物实验中心，雌雄不限，体质量2.0~3.0 g，饲养于重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心，本研究已通过重庆医科大学附属儿童医院动物实验中心伦理审查委员会批准。

1.2 主要试剂

Similac配方奶(Abbott Laboratories公司，美国)；犬代乳奶粉(Pet-Ag公司，美国)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Sigma公司，美国)；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；SDS-PAGE电泳凝胶配制试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司)；5×蛋白上样缓冲液(Biosharp公司)；快速封闭液(上海碧云天巴西vs瑞士让球有限公司)；HIF-1α Rabbit pAb、GAPDH抗体(成都正能生物技术有限责任公司)；0.22 μm PVDF膜(Millipore公司，德国)；TRIzol(Invitrogen公司，美国)；RT Master Mix for QPCR、SYBR(MCE公司)；引物(上海生工生物工程股份有限公司)；4%多聚甲醛、柠檬酸钠修复液(北京赛维尔公司)；DAB显色试剂盒、兔二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Iba-1抗体(abcam公司，美国)，GFAP抗体(Cell Signaling Technology公司，美国)；少突胶质细胞转录因子-2(oligodendrocyte transcription factor 2，Olig2)抗体(GeneTex公司，美国)；2-Methoxyestradiol(Selleck Chemicals公司，美国)；Dimethyloxallyl Glycine(MCE公司)。

1.3 实验方法 1.3.1 动物分组与NEC模型建立

SPF级新生5 d的C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为4组：对照组(CON组，n=15)，坏死性小肠结肠炎组(NEC组，n=24)，HIF-1α稳定剂组(DMOG组，n=19)和HIF-1α抑制剂组(2ME2组，n=23)。

CON组小鼠与母鼠同笼，母乳喂养，不做任何处理。NEC组小鼠依照CHEN等[]的方法建立NEC模型，饲养于恒温保育箱中[温度(36±1)℃，湿度45%~60%]，配方奶(0.03~0.05 mL/g)灌胃喂养，每日5次；于缺氧箱(5%O2+95%N2)中缺氧处理10 min，每日3次；LPS灌胃(5 mg/kg)，每日1次；连续建模4 d。DMOG组建模方法同NEC组，每日腹腔注射HIF-1α稳定剂DMOG溶液(40 mg/kg)[]。2ME2组建模方法同NEC组，每日腹腔注射HIF-1α抑制剂2ME2溶液(5 mg/kg)[]。

1.3.2 生存情况观察

记录小鼠每日死亡情况。

1.3.3 组织取材和切片制备

NEC建模结束后12 h，断头处死所有小鼠，获取胃端至直肠的整肠组织，观察肠道组织的大体形态后，取回肠部用4%多聚甲醛固定；在冰上迅速剥离出脑组织后沿着纵轴将其一分为二，随机取一半冻存于-80 ℃，另一半用4%的多聚甲醛固定。肠道和半脑经脱水和石蜡包埋后，进行切片，切片厚度为4 μm，烘干后备用。

1.3.4 Western blot检测脑组织中HIF-1α的表达

从每组动物中随机选取3只小鼠进行Western blot检测。取-80 ℃冻存的脑组织，加入裂解缓冲液，组织匀浆，4 ℃离心15 min(12 000×g)，收集上清液，用BCA法行蛋白浓度定量检测。取上清液加入5×蛋白上样缓冲液煮沸15 min，冻存备用。取50 μg总蛋白样品进行凝胶电泳，转膜至PVDF膜，封闭15 min，孵育一抗(HIF-1α抗体稀释浓度为1 ∶1 000，GAPDH抗体稀释浓度为1 ∶2 000)，4 ℃孵育过夜，孵育二抗(稀释浓度为1 ∶ 10 000)，ECL显影。分析软件采用Image J，目的蛋白相对表达量以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值表示。

1.3.5 肠道组织HE染色