Cell：癌症治疗新方法，北大杜鹏团队通过植物蛋
癌症作为一种细胞异常增殖的疾病，是全球主要的公共卫生问题。癌症的诱因非常复杂，是胞内多种调控通路的突变和微环境共同作用的结果，其中微小RNA（miRNA）是近年来被认为与癌症发生息息相关的重要 RNA 分子。在哺乳动物中，具有2-nt 3'末端悬垂的成熟 miRNA 双链可以被 Argonaute（AGO）识别并装载形成 RNA 诱导的沉默复合体（RISC）进而调控靶基因的表达。在癌症中，全局 miRNA 剂量减少被认为是癌症发生的诱因之一。然而，迄今为止对于不同癌症中普遍miRNA缺乏的原因尚未被系统陈述。
细胞周期的过度激活是癌细胞异常增殖的必要条件，因此细胞周期基因是抗癌药物研发的重要靶点。现有细胞周期的药物往往只能针对一种或者几种靶点，因而无法克服基因冗余性而带来的耐药性。有意思的是，许多 miRNA 都可以直接靶向并抑制细胞周期基因，从而直接控制细胞增殖。因此，能否通过修复肿瘤中有缺陷的 miRNA 通路从而实现对于肿瘤细胞增殖的抑制，就一直是一个悬而未决的生物学问题。一旦成功，则可开发成为一种肿瘤治疗的新策略。
与 miRNA 不同，siRNA 来源于不同 RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RDR）合成的双链 RNA 底物。有趣的是，RDR 几乎在所有真核生物中都已被发现，但在进化过程中，其在具有次级免疫系统的脊椎动物中丢失。在植物中，依赖 RDR1 的 siRNA 尤其参与抗病毒免疫反应，是植物特有的、最核心的分子免疫反应通路之一。近年来，跨物种生物工程已成功应用于基础研究和转化医学，例如来自细菌的 CRISPR-Cas 系统。因此，研究人员尝试从动植物免疫系统的差异出发，在哺乳动物中进行基于植物 RDR1 的植物基因工程，并研究其相关的转化医学的应用。
2022年5月26日，北京大学杜鹏课题组在 Cell 在线发表了题为：A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency 的研究论文。
该研究发现，在不同的人类原发性癌症样本和癌症细胞系中，不能有效结合 AGO2 复合体的 3'末端短 1-nt 的 miRNA 异构体广泛积累。异位表达的植物免疫蛋白 RDR1 通过其单核苷酸加尾修饰这些 AGO2 游离出的 miRNA 双链异构体，以重新激活有缺陷的 miRNA 通路，从而特异性阻断实体瘤和白血病中癌细胞的细胞周期。在本研究工作中，作者主要有以下发现：
1、RDR1蛋白通过靶向细胞周期广泛抑制癌细胞的增殖
为了在哺乳动物细胞中进行基于植物 RDR1 的生物工程，作者分别从拟南芥（At）和水稻（Os）中克隆RDR1基因到基于 Dox 诱导的慢病毒载体上。最终，本研究获得了13个稳定的 RDR1 诱导细胞系（包括7个实体瘤、3个白血病、3个非癌症细胞系）和2个 RDR1 恒定表达的胚胎干细胞系。通过 Western blot 和活细胞成像，作者验证了 RDR1 在哺乳动物细胞中成功实现了异位表达。
在接下来的研究中，令作者惊讶和意外的是，AtRDR1 和 OsRDR1 能够在体外显著抑制所有10种癌症细胞系的增殖，但对其他5种非癌细胞没有影响。RDR1 还可以显著抑制癌细胞的克隆形成能力。在分子水平上，基于 RNA-seq 的基因集富集分析（GSEA）表明，AtRDR1 和 OsRDR1 可以干扰所有癌症细胞系中的细胞周期过程，但在非癌对照细胞中没有明显作用。值得注意的是，短时间（2-3天）诱导 RDR1 同样可显著抑制癌细胞中的细胞周期过程，表明细胞周期通路可能是 RDR1 的直接作用靶点。
随后，EdU/PI 染色分析显示，RDR1 在癌细胞中的表达显著降低了 S 期的细胞比例，反而增加了 G0/G1 期的细胞比例。因此，作者认为植物免疫蛋白 RDR1 是一种外源肿瘤抑制因子，它能够特异靶向并干扰癌细胞中的细胞周期过程，但在非癌症细胞中却不起作用。
2、在3'末端短1个碱基的受损的miRNA异构体在多种肿瘤中广泛积累
由于 RDR1 参与植物中的小 RNA 通路，作者在 RDR1 诱导表达前后的癌症和非癌症细胞中进行小 RNA 测序。令人惊讶的是，作者发现诱导 RDR1 后的癌症细胞中 miRNA 的整体表达明显增加，但在非癌症细胞系中却没有出现这种现象。随后，作者还通过 miRNA 通路关键组分的敲低和 AGO2-CLIP 等实验，提出植物 RDR1 通过提高全局 miRNA 表达以特异挽救癌细胞中的 miRNA 缺乏来抑制细胞周期和增殖。
为了进一步研究 RDR1 特异靶向癌细胞的机制，作者对已公开发表的小 RNA 测序数据进行系统分析，包括 TCGA 数据库的9980组癌症病人数据以及 GEO 数据库的癌症病人、癌症细胞系以及正常组织的数据。
结果表明，在很多癌症病人和细胞系的样本中，在3'末端短 1-nt 的 miRNA 异构体出现了大量的积累。这些3'末端短 1-nt 的 miRNA 在部分癌症样本中甚至成为不同 miRNA 异构体中数量最多的群体。由于 AGO 蛋白结构的特殊性，2-nt 悬垂的结构有利于 miRNA 双链进入 AGO2 中形成 RISC。
作者提出，这种 1-nt 悬垂的异构体，相比于 2-nt 悬垂的异构体进入 AGO2 的效率更低，并通过 EMSA 和 MST 实验进行了验证。同时，通过 AGO2-IP 的小 RNA 测序，作者进一步分析发现3'末端短 1-nt 的 miRNA 异构体在 Input 组更富集，进一步表现出短 1-nt 的 miRNA 异构体进入 AGO2 的效率更低。综上，作者提出，在癌细胞中，这种短 1-nt 的异常 miRNA 双链异构体不能有效地进入到 AGO2 中，并且不稳定，因此可能与不同肿瘤中的 miRNA 剂量减少有关。
3、RDR1 通过单核苷酸加尾修复癌症中有问题的 miRNA 异构体
据报道，植物 RDR6 同时具有 RNA 聚合酶和核苷酸转移酶活性，而在后续的小RNA测序数据分析中，作者发现具有3'端单核苷酸加尾的成熟 miRNA 特异富集于 RDR1 异位表达的癌症细胞中。有趣的是，这种单核苷酸加尾主要出现在3'末端短 1-nt 的 miRNA 上，但很少出现在注释的切割末端上。随后作者在大肠杆菌中纯化出重组的 rAtRDR1 和酶活位点突变的 3DA mutant rAtRDR1。通过体外生化实验，作者直接证明了 rAtRDR1 能够对单链 miRNA 和具有 1-nt 或 2-nt 悬垂的 miRNA 双链进行3’末端单核苷酸修饰，但不能修饰具有平末端的 miRNA 双链。
结合以上的发现，作者设想 RDR1 倾向于识别 AGO2 中游离出来的具有 1-nt 悬垂的 miRNA 双链作为底物，这些异构体尤其在癌症细胞中积累，但在非癌症细胞中不积累，并用单核苷酸加尾修饰这些有问题的 miRNA。为了验证这一点，作者首先在表达 RDR1 的肺癌 A549 细胞中进行了 AGO2 敲低实验，随后进行小 RNA 序列分析。正如预期的那样， AGO2 缺失确实进一步加强了 RDR1 介导的 miRNA 修饰，在癌细胞中短 1-nt 的 miRNA 异构体上单核苷酸加尾的比例大幅提高。之后，体外将 rAGO2 与具有 1-nt/2-nt 悬垂的 miRNA 双链预孵育后再加入 rRDR1 进行游离 miRNA 双链的加尾实验，结果显示与 AGO2 亲和力较低的 1-nt 悬垂的 miRNA 双链在与 rAGO2 蛋白预孵育后更倾向于被 RDR1 修饰。
最后，作者还通过给 1-nt 悬垂的 miRNA 双链加尾后的重新结合，1-nt/2-nt 外源 miR-34c 双链的体外转染等实验和分析，共同证明了 RDR1 拥有核苷酸转移酶活性，能够对 AGO2 中游离出的短 1-nt 的 miRNA 双链异构体进行单核苷酸修饰，以恢复这些异构体对 AGO2 的装载效率，并最终修复癌症中有缺陷的 miRNA 通路。
4、RDR1 抑制多种小鼠实体瘤和白血病的进展
接下来，作者想在小鼠体内验证植物 RDR1 的抗肿瘤作用。首先，作者将 RDR1 诱导型癌症细胞系注射免疫缺陷小鼠以进行体内荷瘤实验，并且通过 Dox 喂水以实现 RDR1 的异位表达。 结果表明，野生型而非突变型RDR1 显著抑制了形成肿瘤的大小、体积和重量。作者还发现，在 A549，H1299 和 PC-3 细胞所成的荷瘤中，植物 RDR1 能够显著提高癌细胞中 miRNA 的表达，从而抑制了癌细胞的细胞周期。
类似的，作者还评估了 RDR1 在体内白血病小鼠模型中的抗肿瘤作用。与载体对照或突变的 RDR1 相比，野生型 RDR1 能够显著抑制三种白血病细胞系（Jurkat、K562和NALM6）在免疫缺陷小鼠外周血中的增殖，并最终延长异种移植小鼠的寿命。同样，RDR1 可以在体内显著增加白血病细胞中的 miRNA 表达以抑制白血病细胞中的关键细胞周期组分，包括 CDK1、CCNE2、PLK1、CDK6 等，从而抑制细胞周期。
最后，通过纳米囊泡包装体外纯化的 RDR1 蛋白和 AAV 包装的 RDR1，分别在体外细胞和体内实体瘤水平上实现了 RDR1 的直接递送和肿瘤抑制。
综上，此项研究首次揭示了在各种人类原发性肿瘤中广泛积累异常的3'末端短 1-nt 的 miRNA 异构体，这为理解肿瘤发生过程中全局 miRNA 剂量的减少提供了新的见解。利用植物免疫蛋白 RDR1，通过挽救癌细胞中的 miRNA 缺陷来实现广谱的抗肿瘤反应，并开发了一种新的策略来编辑和操纵 miRNA，使之成为对抗癌症等人类疾病的强大武器。
北京大学生命科学学院/北大-清华生命科学联合中心的杜鹏研究员为该论文的通讯作者。北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生齐烨和生命科学学院博士研究生丁力为本文的并列第一作者。北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生张司文参与了部分工作，北京大学博士研究生姚升泽（已毕业）和博士后翁健莉也对本文有重要贡献。北京大学李毅和吴虹教授合作参与完成了这一工作，并给予了大力支持。
博士后招聘：
北京大学杜鹏实验室依托于北京大学生命科学学院和北大-清华生命科学联合中心，从事RNA调控，干细胞及肿瘤生物学的相关研究。主要致力于分析和鉴定未知的RNA调控通路，并研究相关RNA调控通路在胚胎干细胞的分化命运决定和早期胚胎发育中的功能。同时，我们也尝试于在动物细胞中重组植物或微生物中特异的RNA调控通路，并研究其潜在的转化医学中的应用。现诚聘博士后2-3名。
详细信息请见链接：
论文链接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00528-1
上一篇：2173，与以往核苷酸，机制创新并有所改进
下一篇：中关村与优迅医学签署合作框架，拟在基因检测、核酸检测等方面开展合作