浅谈mRNA疫苗制备工艺

作者：张馨予

　　将编码抗原蛋白的mRNA导入人动物细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，即mRNA疫苗。

　　随着mRNA疫苗的上市，其生产工艺也正在逐渐趋于成熟，具体制备工艺流程图大致如图1所示。

图1. mRNA疫苗的制备工艺流程图

　　1）制备线性质粒

　　DNA的制备工艺，相对mRNA而言，已经相当纯熟。好比Cytiva的经典质粒三步法，通用性高、稳健性强、可进行全面的放大，不失为一个好的质粒制备工艺。而新兴技术RCA（Rolling CircleAmplification）制备线性质粒（图2所示），化繁为简。其过程全然不需要细胞参与，从而免去了大肠杆菌的发酵、表达、收获、纯化等过程，将其7~8天的工艺时长缩短为1~2天，大大提高了工作效率。

图2. RCA制备线性质粒

　　2）mRNA的体外转录与帽化反应

　　mRNA的体外转录与帽化反应过程相较其他大部分的疫苗生产方法更为安全快捷，但它所依赖的原材料却相对昂贵。RNA的体外转录一般以含有靶蛋白开放阅读框的质粒DNA或其他DNA片段作为模板，加入提供核苷酸碱基的三磷酸核苷（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶）、RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂、焦磷酸酶（降解焦磷酸防止转录抑制）、镁离子（作为聚合酶的辅因子）以及含有抗氧化剂与多胺的缓冲液。目前体外转录过程在GMP条件下进行大规模生产，不得不说，仍是个不小的挑战。怎样确保加入的原材料均无动物来源且达到GMP级别，又怎样确保这些原材料的可及性，都是我们需要关注的问题。

图3. RNA的体外转录

　　3）特异性捕获

　　关于mRNA体外转录后的捕获或是加帽之后的捕获工艺，已相对明朗。

　　Sera-Mag Oligo (dT)磁珠（Cytiva）可以高特异性结合mRNA poly A尾巴来捕获mRNA，载量可以达到12 ug mRNA/ml，同时收率在90%以上（如图4）。然而对于大规模GMP生产来讲，碍于操作流程与成本来讲，磁珠的放大应用相对局限。

图4. Sera-Mag Oligo(dT)高特异性捕获mRNA

　　CIMmultus Oligo dT (BIA separations)可同样通过结合poly A尾巴高效捕获mRNA，并且流速高（保留时间约为1 min）、剪切力小，载量可高达180 ug/ml，同时此步收率高达95%以上（如图5）。

图5. CIMmultus OligodT高特异性捕获mRNA

　　POROS Oligo (dT)25 (Thermo Fisher)的原理同样是高效捕获mRNA的poly A尾巴，对于1000nt，2000nt，3000nt的mRNA，载量均高达mg/ml级别，收率均在90%以上。对应10%的流穿点，3000nt的mRNA的载量可高达3 mg/ml，同时收率~92%（如图6）。

图6. POROS Oligo(dT)25高特异性捕获mRNA

　　4）精细纯化

　　高特异性捕获步骤之后，通常也可衔接中空纤维换液步骤，置换缓冲液的同时还可以去除小核酸片段等杂质。对于大型RNA来说效果更为显著，一般可实现90%~95%高产率，甚至还可取得99%的高纯度，同时保留纯化的RNA的稳定性与效应。

　　对于一些杂质挑战性的项目而言，CIMmultus PrismaS兼具阴离子交换作用与疏水作用，在pH梯度的洗脱条件下，可以将DNA、残留蛋白以及dsRNA与目标ssRNA进行有效的分离，杂质会先于ssRNA洗脱下来。pH洗脱前若是增加一步高盐（如1 M NaCl）淋洗，可更加有利于dsRNA、DNA与蛋白的去除。

图7. CIMmultus PrismaS精细纯化mRNA

　　5）载体递送

　　对于mRNA来说，若要有效发挥其功效，其mRNA递送系统是重中之重。影响mRNA递送系统的因素有很多，翻译的效率、佐剂性、剂量等等。从早前的鱼精蛋白作为递送载体到现在的脂质纳米颗粒（LNP）递送载体，mRNA的载体技术取得了飞跃式的发展。

　　目前临床试验中的所有mRNA递送系统均为脂质纳米颗粒，该结构图如图8所示。已上市的Moderna的mRNA疫苗和辉瑞-BioNTech的mRNA疫苗也均采用脂质纳米颗粒作为递送载体。当然，递送载体技术仍在飞速发展，独特双层结构的LPP mRNA技术平台的开发，都是在为完善mRNA疫苗生产工艺而努力。