海洋来源链霉菌OUCMDZ
海洋链霉菌凭借其巨大的生物合成潜力在微生物种群中占据重要地位，其次级代谢产物具有多种生物活性，如抗菌、抗肿瘤以及抗氧化活性等[]。Streptomyces sp. OUCMDZ-3434是一株分离自山东青岛栈桥浒苔样品的海洋链霉菌，其发酵产物中含有类型丰富的Wailupemycin类化合物，其α-糖苷酶抑制活性明显优于阿卡波糖[]，但产量较低，影响了其进一步开发应用。
链霉菌具有复杂的发育及形态分化过程，能够产生多种次级代谢产物，为了适应生长环境中温度、pH值、营养条件等变化，链霉菌需要复杂的调控网络对外界环境变化做出反馈[]。调控因子对基因表达的调控作用主要分为途径特异性调控以及全局性调控两种。途径特异性调控基因通常位于次级代谢产物生物合成基因簇中，对该基因簇编码产物的合成具有调控作用[]。全局性调控基因大多位于基因簇外，能够将对外界环境反馈的信号传递给不同的途径特异性调控基因，从而调控多个代谢途径[]。在全局性调控基因中，WhiB-like (Wbl)家族的wblA在不同的链霉菌中参与了多种次级代谢产物的生物合成以及形态分化的调控[]。例如，在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)中wblA是一个负调控因子，阻断wblA基因后，放线紫红素Actinorhodin的产量增多，突变株的气生菌丝变为红色，产孢能力减弱[]；通过阻断Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66中的wblAso基因，一个Ⅲ型PKS生物合成基因簇被激活，在该突变株中分离到了具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性的次级代谢产物——Violapyrone B，并且该突变株丧失了产生孢子的能力[]。
在我们的前期研究中，通过对Streptomyces sp. OUCMDZ-3434全基因组测序及生物信息学分析，发现其基因组中含有一个wblA基因，推测该基因对OUCMDZ-3434的次级代谢产物具有调控作用。为进一步明确其功能，实验建立了Streptomyces sp. OUCMDZ-3434的遗传转化系统，并通过敲除其wblA基因，研究了wblA基因对Streptomyces sp. OUCMDZ-3434次级代谢与形态分化的影响。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒本研究所用菌株、质粒及其特性参见。Streptomyces sp. OUCMDZ-3434分离自山东青岛栈桥浒苔样品[]。大肠杆菌ET12567/pUZ8002[]和E. coli BW25113/pIJ790[]为常用工程菌。
表 1 本研究中用到的菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株/质粒
Strain/plasmids
相关特性
Correlation characteristics
来源或参考文献
Reference or source
Streptomyces sp. OUCMDZ-3434
野生株
OUCMDZ-3434 wild type strain
[]
LX01
野生株含有pSET152质粒
OUCMDZ-3434 harboring pSET152
本研究This study
LX02
wblA双交换阻断突变株
OUCMDZ-3434 wblA gene inactivation mutant
本研究This study
DH5α
supE44, ΔlacU69 (Ψ80lacZΔM15), hsdR17, recA, endA1
Stratagene
BW25113
K12 derivative: ΔaraBAD，ΔrhaBAD
[]
ET12567
(dam- dcm- hsdM-), CmR
[]
pIJ773
aac(3)Ⅳ(AprR), oriT
[]
pSET152
aac(3)Ⅳ, int, oriT, attP
[]
WB
含有wblA DNA片段的Cosmid
Cosmid harboring wblA
本研究This study
WBΔwblA
WB中wblA基因被AprR取代的重组Cosmid
WB with wblA replaced by AprR
本研究This study
常用培养基LB、TSBY、MS配方参见文献[]。发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉10.0，酵母膏10.0，葡萄糖20.0，牛肉膏3.0，玉米膏4.0，KH2PO3 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCO3 2.0，海水素30.0，调节pH值至7.0。
1.3 主要试剂和仪器Taq聚合酶，TIANGEN公司；DNA胶回收试剂盒，OMEGA公司；阿普拉霉素(Apramycin，Apr)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、萘啶酮酸(Nalidixic Acid，NA)、氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、四环素(Tetracycline，Tet)、硫链丝菌素(Thio)等，生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR引物合成和测序工作由青岛擎科梓熙生物技术有限公司完成，本研究所使用的引物见。化合物Wailupemycin G标准品由中国海洋大学朱伟明老师实验室提供。生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；冷冻离心机，Thermo公司。
表 2 本研究使用的引物 Table 2 Primer pairs used in this study
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