基因转染细胞的效率如何测定

作者：张馨予

以腺病毒为载体转染细胞是常用的实验技术，以下是丁香园论坛网友关于基因转染细胞效率测定问题的讨论：

网友[weekend]问：
我欲做目的基因转染细胞实验，用腺病毒载体转染，请问可以用哪些方法检测转染效率？哪种简便准确？

网友[tianjin_glioma]答：
X-gal染色鉴定转导效率：
（1）标本的制备：将适当数量的目的细胞接种于灭菌盖玻片上，5% CO2，37℃，孵育12小时；按MOI=100加AdCMV-βgal病毒提取液，孵育24小时；鼠脑标本则采用冰冻切片。

（2）X-gal染色：将标本立即放入固定液（2%甲醛，0.2%戊二醛溶于1×PBS中）中固定5分钟，去离子水洗1分钟；室温晾干，1×PBS洗5分钟；加X-gal显色底物（1mg/ml X-gal, 5mM 铁氰酸三钾，5mM 铁氰酸四钾，2mM 氯化镁溶于1×PBS），避光37℃孵育30分钟-24小时（每2小时取出观察染色情况）；染色满意后以1×PBS洗5分钟，去离子水洗2分钟×2；以核固红染核3分钟，封片。

如果是GFP或EGFP标记的病毒，直接计数荧光阳性细胞数就可以了。

网友[weekend]问：
我看有的文献上用Ad-lacz做对照，然后加X-gal,测转染率是啥意思？

网友[tianjin_glioma]答：
按MOI=100加AdCMV- gal粗提液于培养细胞上，孵育24小时，进行X-gal染色，MOI=100时100%细胞胞浆为蓝色；而对照胞浆无染色，为阴性。表明AdCMV-gal能高效转导细胞，并表达Lac-Z蛋白

解释：
1、注射AdLacZ的病毒用X-gal染色液染色、伊红衬染，镜下观察，计算重组腺病毒AdLacZ感染蓝染细胞面积百分率.
2、腺病毒携带有细菌lacZ基因，后者表达的蛋白产物β-半乳糖苷酶与底物x-gal发生化学反应后呈蓝色，故LacZ的表达率可以代表病毒转导率

注意：
    用病毒感染细胞称转导
    质粒导入细胞称转染
    质粒导入细菌称转化

    网友[weekend]问：
    我转导的基因是IL-2，用重组腺病毒荷载后组成Ad-IL-2，Ad-lacZ作为对照组，通过测Ad-lacZ的转导率就能说明Ad-IL-2的转导效率吗？准确吗？
    还有两个问题：
    (1)AdCMV- gal是啥意思？CMV代表啥？
    (2)一般腺病毒转导效率如何？优缺点有哪些呢？与脂质体相比呢？

网友[tianjin_glioma]答：
AdCMV- gal是携带X-gal基因的对照病毒载体；CMV是巨细胞病毒的启动子。

一般腺病毒转导效率在MOI为1：50-100时效率在90%以上。但这种转导是表位表达，表达时间一般在1个月。丁香园内有许多相关帖子可以参考。

脂质体转染效率一般在5%以下。有文章宣称LIPOFECTAMINE效率在30-50%，我们在肿瘤细胞中没有发现上述情况。脂质体转染后一般需要抗菌素筛选阳性克隆。如果条件允许，研究级的课题还是应该选择病毒系统。

病毒载体主要为逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体。

逆转录病毒载体（Retrovirus）具有相对高效的转染率，可以稳定地整合到靶细胞基因组中并且长期表达；但是逆转录病毒只转染分裂期细胞、基因信息携带量较少、无控性同源重组可以导致新病毒的复制等是其不利之处。腺病毒载体（Adenovirus）可以获得高滴度的病毒载体，没有严重的副作用，可以转染非分裂细胞以及多种类型细胞，在体内不被激活、缺乏致基因突变作用。但腺病毒载体的免疫源性使外源性基因不能整合到细胞基因组中、在细胞分裂若干次后可以发生丢失现象。腺相关病毒载体（Adeno-associated Virus）是一种单链线状DNA病毒，只有与腺病毒或单纯疱疹病毒或痘苗病毒共感染时才能进行有效复制和产生细胞性感染，可以能特异地整合于人类第19对染色体的长臂中从而减少重组腺相关病毒插入突变的危险性，宿主范围广、易生长、稳定性好、便于浓缩,纯化和灭活。虽然腺相关病毒的辅助病毒在载体加工后降低了神经毒性，但是其转染效率低，细胞毒性随转染倍增。单纯疱疹病毒载体（Herpes Simplex Virus）是一类双链DNA病毒，可感染非分裂细胞、病毒滴度高，对神经系统有天然的亲和性；但单纯疱疹病毒病毒蛋白对宿主细胞有毒性，迄今尚未建立既无致病作用又能持续表达的单纯疱疹病毒的表达载体.
在现有的各种转基因途径或载体中,各有相应的长处和缺点,还没有理想的基因投递系统适宜胶质瘤的基因治疗。