【求助】T4DNA连接酶到底反应多长时间最佳？非常

作者：杨超月

我来就Ｔ４连接载体谈谈自己的经验，希望能给楼主一点帮助．
１.首先楼主要搞清楚自己的两段的酶切位点是什么？估计肯定是粘端切口，但是有的粘端切口的连接是要平端的连接条件，比如Xhol I就是产生粘端切口，但是推荐使用平端连接条件．我用过３种Ｔ４连接酶，只有ferment的说明书上有平端连接的反映体系，promega and takara都没有．所谓粘端连接条件也就是加入ＰＥＧ４０００，这个东西很便宜，３０块钱一大瓶．我做过对照,加入PEG4000的长出的克隆个数可能是没有加入的5倍多.
2.楼主连接的片段有多长?越长肯定越难连接,我有一个形象的比喻,DNA片段就是好比一个毛线,越长的毛线缠绕成的毛线团就越大,也就越难找到它的两头,是不是?我把一个4000多BP的序列连接到载体上,开始也是很难连接上，后来我用平端连接条件,4度连接48小时多,期间去弹刮混匀数次,结果做出来克隆了.我们实验室其他一个同学的长片段连接也是采用超长连接时间而最后做成功了.如果楼主是长片段连接,我强烈建议长时间的4度反应.
3.载体和目的片段的比例问题,不知道楼主是怎么估计他们各自的浓度的?我们这里发现测OD值不是很准.需要电泳和相应的MARKER比较亮度才是比较准确的,你可以看看自己的DL2000跑出的条带,100BP的那条带很微弱而2000BP的很亮,但是TAKARA的说明上是每条带浓度都是10ng/ul．所以根据自己的目的条带和载体的大小，选择相应的ＭＡＲＫＥＲ进行电泳来估测浓度．
４．保证所有使用的试剂都是自己很清楚没有问题的．保证酶切后的质粒和目的基因回收都是正确的．
５．楼主一定要清楚，装载体是一个非常非常常规的分子生物学实验内容，所以做不好大部分原因是自己的．除了你做的片段的确很长很短或是很特别．

祝你好运！也祝我好运能得分！