C12orf40基因的应用

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

c12orf40基因的应用
技术领域
1.本发明涉及生殖遗传技术领域，特别是涉及一种与非梗阻性无精症相关的 c12orf40基因的应用。

背景技术：

2.男性不育是一种由多因素引起的表型异质性疾病，包括少、弱、畸形精子症、无精子症及其他原因不明的男性不育。其中，非梗阻性无精症(non-obstruction azoospermia，noa)是男性不育最严重的一种表型，主要由包括染色体异常、 y染色体azf微缺失、基因突变在内的遗传缺陷而引发的精子发生障碍所致，临床上目前缺乏使患者恢复生精功能的治疗手段，主要通过供精生育下一代。随着以全外显子测序为代表的新一代测序技术在遗传病致病基因筛查中的广泛应用，一些导致noa的致病基因突变陆续被发现，这为noa患者的诊断、预防和生育治疗提供了重要的分子依据。
3.然而，相当一部分noa患者进行基因检测后，由于检出的基因变异缺少功能研究证据，无法判断变异是否与noa相关，称之为“临床意义不明变异”，这为noa患者的精准防治带了巨大的挑战。

技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种新的可用于检测或治疗非梗阻性无精症的生物标志物。
5.本发明提供了一种c12orf40基因作为生物标志物在制备用于检测或治疗非梗阻性无精症的产品中的应用。
6.本发明还提供了一种突变型c12orf40基因，所述突变型c12orf40基因的核苷酸序列与野生型c12orf40基因的核苷酸序列相比具有c.1286+1g》a突变。
7.本发明还提供了一种突变型c12orf40蛋白，所述突变型c12orf40蛋白的氨基酸序列与野生型c12orf40蛋白的氨基酸序列相比具有p.lys405fs突变。
8.本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述的突变型c12orf40基因。
9.本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组中掺有如上所述的突变型c12orf40基因。
10.本发明还提供了如上所述的c12orf40基因、突变型c12orf40蛋白、重组表达载体或宿主细胞在制备非梗阻性无精症动物模型中的应用。
11.本发明还提供了如上所述的c12orf40基因或其编码的c12orf40蛋白的检测试剂在制备用于检测非梗阻性无精症的产品中的应用。
12.在其中一个实施例中，所述检测试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：荧光染料法、数字pcr、共振光散射法、实时荧光定量pcr、测序或生物质谱法。
13.本发明还提供了一种用于非梗阻性无精症的检测试剂，包括pcr引物对，所述pcr引物对能够扩增如上所述的c12orf40基因的全长或部分片段。
14.在其中一个实施例中，所述pcr引物对的上游引物能够与所述c12orf40基因的8号外显子区域互补配对，所述pcr引物对的下游引物能够与所述c12orf40 基因的10号外显子区域互补配对。
15.在其中一个实施例中，所述上游引物和所述下游引物的核苷酸序列分别如 seq id no：2和seq id no：3所示。
16.本发明还提供了一种用于检测非梗阻性无精症的试剂盒，其包括如上所述的检测试剂，以及rna提取试剂、逆转录酶、pcr反应缓冲液、dntps和dna 聚合酶中的至少一种。
17.发明人在临床科研实践中，通过全外显子测序技术筛选鉴定到一个导致非梗阻性无精子症患者的致病基因c12orf40剪切位点变异(nm_001031748.4, c.1286+1g》a)，患者睾丸活检组织中未见单倍体精子，表现为非梗阻性无精子症，该基因特异性表达于睾丸组织，在其他组织中不表达。为了明确该剪切位点变异的致病性，我们抽提了患者的外周血rna，并设计了特异性的pcr引物 (seq id no：2和seq id no：3)，采用rt-pcr技术(第一次扩增以患者外周血cdna为模板，第二次扩增以第一次扩增产物为模板，且两次扩增均采用上述同一对引物)检测该剪切位点变异是否影响rna剪接，结果发现能够扩增出目的片段，且与正常对照相比，存在异常剪接转录本，表明该剪切位点变异影响了rna剪接。进一步对正常对照和患者的上述扩增产物进行sanger测序，结果显示，c12orf40纯合剪切位点变异(c.1286+1g》a)影响了rna剪接，导致第9号外显子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短。由此可知，c12orf40基因可作为非梗阻性无精症的生物标志物，c12orf40纯合剪切位点突变(c.1286+1g》a)会导致非梗阻性无精症，且采用上述特异性引物序列结合rt-pcr技术，可用于外周血不表达或过低表达的noa致病基因 c12orf40的剪切位点变异致病性检测。
附图说明
18.图1为本发明在1例noa患者中发现的c12orf40基因纯合剪切位点变异结果；其中a为通过sanger测序证实该患者携带c12orf40基因纯合剪切位点 (c.1286+1g》a)突变，b为c12orf40在不同组织中的表达谱，c为携带c12orf40 基因纯合剪切位点变异患者(p)的睾丸病理染色结果，与对照(nc)相比，患者睾丸生精细胞中未见单倍体精子，表现为减数分裂阻滞；
19.图2为本发明检测非梗阻性无精子症患者中发现的c12orf40纯合剪切位点变异的剪切模式结果；其中a为rt-pcr检测c12orf40在患者和正常对照外周血rna中的表达及推测可能的剪切模式，b为通过sanger测序检测患者和正常对照中的pcr产物序列，并明确该剪切位点的剪切模式，c为通过生物信息学分析c12orf40纯合剪切位点(c.1286+1g》a)影响rna剪接，导致第9号外显子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
21.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
22.本发明提供了c12orf40基因作为生物标志物在制备用于检测或治疗非梗阻性无精症的产品中的应用。可选地，上述产品可以是试剂、试剂盒、药物或装置等。
23.本发明还提供了一种突变型c12orf40基因，该突变型c12orf40基因的核苷酸序列与野生型c12orf40基因的核苷酸序列相比具有c.1286+1g》a突变，野生型c12orf40基因的核苷酸序列为nc_000012.12(ncbi reference sequences)所示。
24.临床上发现的众多意义不明的变异中，有约20％属于剪切位点变异，这类变异可能与rna剪接有关。rna剪接是指基因序列(dna)剪切掉基因的内含子部分，把外显子片段进行拼接，形成新的rna序列，而这些异常剪接的结果是蛋白质缺失一段氨基酸或者更为常见的翻译提前终止。要明确剪切位点变异是否影响rna的剪接，首先需要获取患者活检组织或外周血rna，然后在致病基因的剪切位点上下游外显子区域设计引物进行rt-pcr和sanger测序，从而对剪切位点变异的致病性进行分析。
25.发明人在临床科研实践中，通过全外显子测序技术筛选鉴定到一个导致非梗阻性无精子症患者的致病基因c12orf40剪切位点变异(nm_001031748.4, c.1286+1g》a)，患者睾丸活检组织中未见单倍体精子，表现为非梗阻性无精子症，该基因特异性表达于睾丸组织，在其他组织中不表达。为了明确该剪切位点变异的致病性，我们抽提了患者的外周血rna，并设计了特异性的pcr引物 (seq id no：2和seq id no：3)，采用rt-pcr技术(第一次扩增以患者外周血cdna为模板，第二次扩增以第一次扩增产物为模板，且两次扩增均采用上述同一对引物)检测该剪切位点变异是否影响rna剪接，结果发现能够扩增出目的片段，且与正常对照相比，存在异常剪接转录本，表明该剪切位点变异影响了rna剪接。进一步对正常对照和患者的上述扩增产物进行sanger测序，结果显示，c12orf40纯合剪切位点变异(c.1286+1g》a)影响了rna剪接，导致第9号外显子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短(seq id no：1)。由此可知，c12orf40基因可作为非梗阻性无精症的生物标志物， c12orf40纯合剪切位点突变(c.1286+1g》a)会导致非梗阻性无精症，且采用上述特异性引物序列结合rt-pcr技术，可用于外周血不表达或过低表达的noa 致病基因c12orf40的剪切位点变异致病性检测。该突变型基因的发现，为进一步研究非梗阻性无精子症的机理，探索非梗阻性无精症的治疗提供了新的实验理论基础和新的方向，丰富了非梗阻性无精症的诊断和检测手段。
26.本发明提供了一种突变型c12orf40蛋白，该突变型c12orf40蛋白的氨基酸序列与野生型c12orf40蛋白的氨基酸序列相比具有p.lys405fs突变，氨基酸序列具体如seq id no：1所示。
27.本发明提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有如上所述的突变型 c12orf40基因。可以理解，载体类型包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。
28.本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞的基因组中掺有如上所述的突变型c12orf40基因。宿主细胞的类型包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk 细胞、hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。可以理解，宿主细胞类型不限于此，可根据需要选择。
29.本发明还提供了如上所述的c12orf40基因、突变型c12orf40蛋白、重组表达载体或宿主细胞在制备非梗阻性无精症动物模型中的应用。通过制备非梗阻性无精症动物模型，能够更方便地研究致病机理，探索非梗阻性无精症的治疗。可选地，上述动物包括哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔或猴等。
30.本发明还提供了上述c12orf40基因或其编码的c12orf40蛋白的检测试剂在制备用于检测非梗阻性无精症的产品中的应用。可以理解，检测试剂可以是针对突变型基因或突变型蛋白的检测试剂，也可以是针对野生型基因或野生型蛋白的检测试剂。
31.在一个具体示例中，上述产品为试剂盒、检测试纸条或检测芯片等，可以理解，具体类型不限于此，各种检测产品均可。
32.在一个具体示例中，上述检测试剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：荧光染料法、数字pcr、共振光散射法、实时荧光定量pcr、测序或生物质谱法等。
33.本发明一实施例的用于非梗阻性无精症的检测试剂，包括pcr引物对，其能够扩增c12orf40基因的全长或部分片段，从而通过pcr或rt-pcr检测 c12orf40基因是否发生突变。
34.在一个具体示例中，pcr引物对的上游引物能够与c12orf40基因的8号外显子区域互补配对，pcr引物对的下游引物能够与c12orf40基因的10号外显子区域互补配对。如此，可以通过对样本逆转录得到的cdna产物进行扩增，然后根据扩增产物的长度即可判断样本是否具有c.1286+1g》a突变，无需进行测序。
35.在一个具体示例中，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no： 2和seq id no：3所示。
36.本发明一实施例的用于非梗阻性无精症的检测试剂盒，其包括上述检测试剂，以及rna提取试剂、逆转录酶、pcr反应缓冲液、dntps以及dna聚合酶中的至少一种。
37.本发明一实施例的非梗阻性无精症的检测方法，包括以下步骤：
38.s1、提供样本；
39.s2、提取上述样本中的rna并逆转录得到cdna产物；
40.s3、通过pcr引物对扩增上述cdna产物的c12orf40基因片段，分析扩增产物。
41.可选地，上述样本选自血浆、全血、淋巴液、尿液、汗液、粘液、痰液和唾液中的一种或多种，优选为外周血样本。
42.在一个具体示例中，在扩增cdna产物的c12orf40基因片段时，使用上述 pcr引物对连续扩增两次以上。考虑到临床上活检组织的难获得性，抽提外周血rna进行剪切位点变异的致病性分析，是目前临床上普遍采用的检测方法。然而，临床上发现noa致病基因均特异性高表达于睾丸组织，在其他组织中不表达或过低表达，导致难以通过外周血rna的rt-pcr对剪切位点变异进行致病性验证。目前，临床上普遍采用mrna异常剪接体外验证实验minigene技术来解决上述问题，但是minigene实验一般耗时1～2个月，导致患者诊断周
期延长。此外，minigene实验还具有成本高的特点，导致难以在临床上广泛推广。因此，本发明通过使用同一pcr引物对连续扩增两次以上，可扩增丰度极低的dna或rna样本，相较于普通pcr技术灵敏度更高，克服样本目的mrna表达极低的限制。
43.我们构建了c12orf40基因敲除鼠，发现c12orf40敲除雄鼠表现为noa表型，而且我们在临床上发现一例noa患者携带c12orf40基因罕见的纯合剪切位点突变(c.1286+1g》a)，由于无法获得患者的睾丸活检组织，我们抽提了患者的外周血rna，采用上述pcr引物对分别进行连续两次rt-pcr和单次rt-pcr，对新发现的剪切位点突变(c.1286+1g》a)进行rna剪切分析，结果发现单次rt-pcr未能扩增出目的条带，而采用连续两次rt-pcr能够扩增出相应目的条带。因此，上述检测方法具有通用性强、成本低、效率高的优点。
44.下面主要结合具体实施方式和附图对去本发明作进一步详细的说明。
45.实施例1
46.在临床科研实践中，我们通过全外显子测序技术鉴定到一个新的导致无精子症患者的致病基因c12orf40剪切位点变异(nm_001031748.4,c.1286+1g》a)，患者睾丸活检组织中未见单倍体精子，表现为非梗阻性无精子症，该基因特异性表达于睾丸组织，在其他组织中不表达(如图1所示)。
47.为了明确该剪切位点变异的致病性，我们抽提了患者的外周血rna，并设计了特异性的pcr引物(seqidno：2和seqidno：3)，采用连续两次rt-pcr技术(即第一次扩展以患者外周血cdna为模板，第二次扩增以第一次扩增产物为模板，且两次扩增均采用上述同一对引物)检测该剪切位点变异是否影响rna剪接，结果发现能够扩增出目的片段，且与正常对照相比，存在异常剪接转录本，表明该剪切位点变异影响了rna剪接(如图2所示)。进一步对正常对照和患者的上述扩增产物进行sanger测序，结果显示，c12orf40纯合剪切位点变异(c.1286+1g》a)影响了rna剪接，导致第9号外显子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短。以上结果表明，采用上述特异性引物序列结合rt-pcr技术，可用于外周血不表达或过低表达的noa致病基因c12orf40的剪切位点变异致病性检测。
48.实验方法：
49.1.1外周血gdna提取及纯化
50.采用德国qiagen公司的dna抽提试剂盒(dnaqiampdnabloodminikit；51106)用于抽提外周血dna，步骤如下：
51.(1)往1.5ml的ep管中加入200μl的全血和20μl的蛋白酶k，混匀；
52.(2)加200μlal，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心3s，56℃水浴15min；
53.(3)加200μl无水乙醇，颠倒混匀，震荡30s，瞬时离心3s；
54.(4)将液体倒入装有离心管的柱子中，13000
×
g，1min，弃滤液和离心管；
55.(5)将柱子放入新的离心管，加500μlaw1，13000
×
g，1min，弃滤液和离心管；
56.(6)将柱子放入新的离心管，加入500μlaw2，13000
×
g，1min，弃掉滤液；
57.(7)弃掉滤液，离心3min，弃掉滤液和离心管；
58.(8)弃掉滤液和离心管，将柱子放在新的ep管中，加入80μl的ae，室温静置5min，13000
×
g，1min，4℃保存或-70℃长期保存。
59.1.2外周血rna提取及纯化
60.采用德国qiagen公司的rna抽提试剂盒(rnaqiamprnabloodminikit，52304)
用于抽提外周血rna，步骤如下：
61.(1)取1.5ml的新鲜全血放到15ml的离心管中，加入7.5ml el，冰上孵育10min；
62.(2)4℃，400
×
g离心10min，去上清，加入3ml el到细胞沉淀中，混匀；
63.(3)4℃，400
×
g离心10min，去上清，加600μl rlt+6μlβ-me混合液，混匀；
64.(4)将混合液倒入到qiashredder spin的柱子中，13000
×
g，2min，扔掉柱子，往滤液中加600μl 70％的无水乙醇，混匀(不离心)；
65.(5)将滤液倒入到新的qiamp spin柱子中，8000
×
g，15s；
66.(6)将柱子转移到新的离心管，加350μl rw1，8000
×
g，15s；
67.(7)加10μl dna消化酶和70μl rdd，室温消化25min，8000
×
g，15s；
68.(8)加350μl rw1，8000
×
g，15s；
69.(9)加500μl rpe，8000
×
g，15s，将柱子转移到新的离心管，13000
×
g， 1min；
70.(10)加入40μl的rnase-free水，8000
×
g，1min。
71.1.3全外显子测序及数据分析
72.取患者外周血gdna 30μg送华大基因进行全外显子测序，wes测序及分析交由深圳华大基因科技有限公司执行，包括dna文库构建、wes上机和数据分析，并使用基因组分析工具包进行变异识别。测序发现的变异(包括单核苷酸变异、小插入或缺失等)均使用annovar软件进行注释，随后对全外测序的注释结果进行个性化的候选致病基因筛选。
73.候选致病基因的筛选策略如下：(1)过滤公共遗传突变数据库(1000 genomes、dbsnp，exac数据库)中频率大于1％的突变；(2)选取生物信息学软件预测(mutation taster，sift，ployphen-2)为可能致病的突变；(3)优先考虑纯合突变或复合杂合突变；(4)选取突变的基因功能与精子发生相关，或特异性高表达于睾丸组织，或模式动物表现为雄性不育表型。
74.1.4pcr及sanger测序验证剪切位点突变
75.将通过全外测序筛选的候选致病基因c12orf40根据突变位点，设计pcr扩增引物。所用引物序列分别为：f:5
′‑
accagtggttttcctctgtacg-3
′
，r： caccctcaaatggcaatacgc-3
′
，pcr扩增体系(30μl)如下：
[0076][0077][0078]
pcr扩增反应条件如下：95℃预变性5min后，94℃变性45s，56～60℃退火30～60s，72℃延伸45s，共34个循环，最后72℃延伸5min，pcr扩增产物放置于4℃保存。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增的目的条带无误后，将剩余的pcr扩增产物送至擎科巴西vs瑞士让球有限公司(北京，中国)进行sanger法测序验证。
[0079]
1.5rt-pcr及sanger测序验证剪切位点突变和rna剪接变化
[0080]
rt-pcr扩增体系(30μl)如下(两轮pcr扩增均用seq id no：2和seq id no：3作为pcr引物)：
[0081]
green master mix，2
×ꢀ
15μl rnase-free water 13μl 患者外周血cdna 1μl(约50ng) 上下引物各0.5μl(10μmol/l) total 30μl [0082]
pcr扩增反应条件如下：95℃预变性5min后，94℃变性45s，56～60℃退火30～60s，72℃延伸45s，共34个循环，最后72℃延伸5min，pcr扩增产物放置于4℃保存。
[0083]
第二轮pcr扩增体系(30μl)如下：
[0084]
green master mix，2
×ꢀ
15μl rnase-free water 13μl 第一轮pcr扩增产物 1μl(约50ng) 上下引物各0.5μl(10μmol/l) total 30μl [0085]
pcr扩增反应条件如下：95℃预变性5min后，94℃变性45s，56～60℃退火30～60s，72℃延伸45s，共34个循环，最后72℃延伸5min，pcr扩增产物放置于4℃保存。将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增的目的条带无误后，将剩余的pcr扩增产物送至擎科巴西vs瑞士让球有限公司(北京，中国)进行sanger法测序验证。
[0086]
1.6琼脂糖凝胶电泳步骤如下：
[0087]
(1)配制2％琼脂糖(tsj001，擎科生物)凝胶：称取2g琼脂糖于500ml 锥形瓶中，加入100ml的1
×
tae缓冲液(tsg001，擎科生物)，微波炉大火加热3min，冷却到35℃左右，加4μl滴核酸染料(tsj003，擎科生物)，混匀，倒入事先安好梳子的槽中，室温冷却；
[0088]
(2)取3μl pcr扩增产物和dl2000dna marker(tsj011-100，擎科生物)进行电泳，220v电泳9min，成像拍摄。
[0089]
实验结果：
[0090]
1、在noa患者中鉴定到c12orf40基因纯合剪切位点突变
[0091]
通过全外显子测序技术在1个noa患者(p)中发现c12orf40基因纯合剪切位点突变(nm_001031748.4,c.1286+1g》a)，采用sanger测序证实患者确实存在该纯合剪切位点突变(如图1a所示)。由于该基因在组织中的表达和功能不清楚，我们随后检测了c12orf40在不同组织中的表达谱，结果显示c12orf40 在睾丸组织中特异性高表达，在其他组织中不表达或过低表达(如图1b所示)。进一步获取患者睾丸活检组织进行病理染色，结果发现，与正常对照(nc)相比，患者睾丸生精小管中未见单倍体圆形精子细胞，提示减数分裂阻滞(如图 1c所示)。
[0092]
2、c12orf40基因纯合剪切位点突变影响rna的剪接
[0093]
为了明确该剪切位点变异的致病性，我们抽提了患者的外周血rna，并设计了特异性的pcr引物(f：5
′‑
ccagaaaaatgtcagccaaacaag-3
′
，r： 5
′‑
tccaaagtcccatgactgctta-3
′
)，采用rt-pcr技术检测该剪切位点变异是否影响rna剪接，结果发现能够扩增出目的片
段，且与正常对照相比，存在异常剪接转录本，表明该剪切位点变异影响了rna剪接(如图2a所示)。进一步对正常对照和患者的上述扩增产物进行sanger测序，结果显示，c12orf40 纯合剪切位点(c.1286+1g》a)影响rna剪接，导致第9号外显子缺失，引起终止密码子提前，从而使翻译的蛋白发生截短(如图2b～2c所示)。以上结果表明，c12orf40基因可作为非梗阻性无精症的生物标志物，c12orf40纯合剪切位点突变(c.1286+1g》a)会导致非梗阻性无精症，且采用上述特异性引物序列结合rt-pcr技术，可用于外周血不表达或过低表达的noa致病基因c12orf40 的剪切位点变异致病性检测。
[0094]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0095]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。