【实力比拼】RNA微量建库技术哪家强？哦，原来
【实力比拼】RNA微量建库技术哪家强？哦，原来是……
2022-08-17 15:56 来源: IDT埃德特
原标题：【实力比拼】RNA微量建库技术哪家强？哦，原来是……
RNA 测序 (RNA-seq) 是一种常见的技术，用于分析细胞的转录组并观察基因表达的变化。典型的实验需要从研究样本中分离 RNA 并反转录成 cDNA 文库，然后进行下一代测序（NGS）和生物信息学分析。RNA-seq 文库制备方法的选择取决于几个因素，例如成本、RNA 质量和 RNA 建库起始量。高性价比的RNA微量建库方法特别令人感兴趣，因为成本、时间和材料是高通量基因表达实验中的关键限制因素。
为了更全面比较链特异性的RNA微量建库方法，研究人员采用由 Integrated DNA Technologies (IDT) 提供的原Swift RNA试剂盒和 Swift Rapid RNA试剂盒两款试剂盒（现已被IDT埃德特公司收购）与 Illumina TruSeq Stranded mRNA试剂盒做了系统的比较分析，研究成果发表在国际知名的Nature子刊 Scientific Reports杂志。
2021年3月，丹纳赫集团生命科学平台旗下公司Integrated DNA Technologies (IDT埃德特) 完成对于Swift Biosciences的收购，产品名称更新如下（表1）。
研究人员比较了3种不同的微量RNA (< 100 ng)生成高质量文库的方法，其中Swift RNA 建库试剂盒和 Swift Rapid RNA 建库试剂盒的起始量可分别低至 10 ng 和 50 ng，而 Illumina TruSeq Stranded RNA 试剂盒的最低建库起始量为 100 ng。虽然RNA 在人体内含量较丰富，但由于一旦患病，检测内容较多，采用微量样本进行RNA测序就显得特别有价值。
在整个实验中，研究人员使用通用型的人类参考 RNA（Universal Human Reference RNA，UHRR）作为参考标准去评估基因表达情况，UHRR由来自 10 种人类癌细胞系的等量总 RNA 组成。所用的3种试剂盒也都可兼容自动化，从而能大幅度提高生产力、确保结果的重现性和稳定性并尽可能地减少人为误差。
表 2. 文库制备试剂盒比较和成本分析
注** 文中价格为国外定价，包括塑料耗材、上游 poly-A 选择试剂盒、文库制备试剂盒、SPRI 磁珠和定量试剂盒的成本。国内具体价格请联系国内区域销售
RNA文库制备过程中需要考虑的另一个因素是链特异性。由于人类基因组中存在重叠基因（overlapping gene），这些基因可从相反的链转录并编码具有不同功能的蛋白质。因此，区分样本中表达哪条链的能力至关重要。最早期的RNA-seq存在的严重缺点就是没有保留链特异性，这使得对基因表达水平（特别是重叠基因）进行量化变得十分具有挑战性。本研究中使用的3种产品都是链特异性的，其中Illumina TruSeq Stranded RNA文库试剂盒使用 dUTP 标记来降解第二条链；现属于IDT埃德特公司的两款RNA试剂盒都是基于Adaptase专利技术，通过仅产生一条与 3' 截短接头连接的功能链来保持链特异性。值得一提的是，IDT 公司的Adaptase专利技术一直以来也是业界领先的建库技术的代名词。Adaptase专利技术可将第一链cDNA直接转化为一致的高质量文库，省去了常规第二链cDNA合成的繁琐，该文库引物二聚体含量低，且对RNA的起始量要求同样低。与相同RNA起始量的其他试剂盒相比，Adaptase技术构建的文库显示出优异的数据产出和均一性，与许多上游和下游模块兼容，并且更易于实现自动化。
IDT埃德特的Adaptase专利技术可将文库制备时间分别缩短至 4.5 h和3.5 h（图 1）。在实验操作中，使用随机引物可将片段化的 mRNA 逆转录为第一链 cDNA。然后将截短的接头直接连接到单链 DNA (ssDNA) 上，从而无需合成第二链。随后是延伸、连接，最后进行index PCR扩增。Adaptase技术提升了read的比对率、提高了通量并增加了文库复杂性和覆盖均一性；另外，Rapid RNA建库试剂盒是该工作流程的加速版本，不包括延伸和连接步骤，截短接头偶联的随机引物启动逆转录反应。然后，Adaptase技术将第二个 3' 截短的接头添加到第一条单链DNA 上后进行index PCR扩增。测序采用Illumina 平台，每个样品平均测20 M reads，随后进行生信分析。
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