一种干细胞无血清培养基的制作方法

作者：张馨予

1.本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种干细胞无血清培养基。

背景技术：

2.rho gtp酶(rho gtpase)属于ras超家族，参与细胞迁移、吞噬、收缩和粘附等活动。rock又称rho激酶(rho-associated kinase)，是目前功能研究最为详细的rho下游靶效应分子。rho/rock信号通路诱导细胞骨架重组、细胞迁移和应力纤维形成，与内皮通透性、组织收缩和生长等多种生理功能有关，参与糖尿病、眼疾病、肿瘤、心脏病、神经损伤性疾病、高血压、辐射损伤和白血病等疾病的发生，作为药物研发靶点越来越受到人们的关注。
3.rho/rock信号通路通过rho与gtp结合激活下游rock，并进一步磷酸化rock下游底物，重塑细胞骨架、诱导肌动蛋白丝稳定和肌动蛋白-肌球蛋白收缩、组合肌动蛋白网和肌球蛋白纤维、调节微管动力。由于rho、rock在体内分布广泛，因此以该通路作为靶点的药物潜成功较大。
4.肿瘤细胞在基质中的运动由4个循环往复的步骤组成，即头部伪足的形成和延伸，新粘附位点的建立，胞体的收缩以及尾部的退缩，通过不断重复的4个过程向前迁移。对这一过程精确调节的分子机制非常复杂，涉及胞内多条信号转导通路。在多条信号级连反应通路中，rhogtp酶尤其是rhoa、rac1和cdc42是关键的调控因子，主要参与对细胞形态改变，细胞与基质粘附及细胞骨架重组的调控，调节肿瘤细胞的侵袭转移过程。细胞形态改变伪足形成和细胞形态改变是侵袭转移的起始步骤。rac可诱导质膜突起形成片状样的层状伪足，而cdc42诱导指头样突起的丝状伪足形成。在高侵袭和转移性的肿瘤细胞，还可见一种侵袭伪足形成，由于与细胞外基质降解密切相关，可能成为主要的伪足结构。层状伪足与周围基质形成粘附连接，产生细胞向前运动的锚着位点；丝状伪足有助于细胞对周围环境的适应及确定细胞迁移的方向。因此抑制rhogtp酶有助有抑制肿瘤细胞。
5.研究者们发现基底样和三阴性乳腺癌中rho gtp酶rnd1是一个潜在的肿瘤转移抑制因子。敲除rnd1蛋白破坏了上皮细胞的粘连和极性，导致上皮-间质细胞转化的发生，同时胞内的c-myc表达发生紊乱、肿瘤抑制因子p53受到抑制，也导致了细胞产生肿瘤化转变。研究显示rnd1通过激活plexinb1蛋白的gap结构域抑制ras信号的传导，从而抑制rap1的功能。而在乳腺上皮细胞中抑制rap1会导致小鼠长出未分化但浸润性高的肿瘤。相反的，rnd1的正常表达能够压制小鼠乳腺癌的自发性肺部转移。基因组学研究数据表明人类乳腺癌组织中rnd1基因的功能受到抑制，主要机制是通过表观遗传学沉默，或极罕见的点突变造成该基因被删除。这些实验结果向我们揭示了之前未曾想见的乳腺癌发生发展机制
‑‑
rnd1限制了ras-mapk信号通路。rho gtp酶家族的新成员能为乳腺癌治疗提供新的药物开发靶点。在其他癌中通过抑制rnd1的活性，也有研究能够用于治疗癌症。
6.真核细胞的分裂周期是一个基础的生物学过程，它需要非常精准分子活动来保证dna的准确度和维持细胞稳态。有研究表明rock蛋白在调节细胞增殖中发挥作用，在细胞增殖g1/s期以及有丝分裂过程中rock被活化。过表达或活化rocki或rock2可引起细胞增殖。
此外，rock活化可诱导catenin及其转录靶点c-myc的表达升高，增强细胞株和小鼠表皮细胞的增殖，抑制rock活力会延迟胞质分裂，也会促进g1期中心粒的异常分离，从而在有丝分裂过程中出现过早的中心体迁移，表明rock活性在细胞周期的调节中起着重要的作用。细胞周期g1期是一个限制性节点，这一时期可以评价dna的完整性以及确定一个细胞是否处于细胞周期循环，抑或是恢复到静止的go期。在nih-3t3成纤维细胞中异位的rock表达可以刺激细胞s期的进程，并且增加g1/s期依赖的细胞周期蛋白(cyclin)d1的水平。相反，在角膜上皮细胞中抑制rock活性会削弱g1/s期的转变，这也在心肌细胞中得到了验证，抑制rock可以减少cyclind3以及周期蛋白依赖的激酶(cdk)6和p27的表达。此外，在胞质分裂时rock蛋白活化会导致富有肌动蛋白的分裂沟的形成，同时伴随着在分裂沟下的if的分解。抑制rock活性会延迟子代细胞的分裂，表明rock活性的精确调节对于细胞分裂的完成很重要。
7.目前已有研究表明在现有的干细胞扩增基础上，通过施加特异性rho激酶抑制剂可以促进干细胞分裂过程中dna的合成，促进干细胞的增殖和分裂，最大限度的实现干细胞的体外快速扩增，能够大量获得种子细胞。但是目前，针对rho激酶抑制剂的种类还不够多，特别是生物活性和安全性更好的抗体类抑制剂还不够多。

技术实现要素：

8.本发明一方面，以rho gtp酶1(rnd1)作为免疫原，通过小鼠，制备了rho gtp酶单克隆抗体rnd1-23单克隆抗体。
9.通过本领域常规的解离常数测定方法，得到rnd1-23单抗亲和力解离常数(kd)为5.17
×
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－10
，属于高亲和力抗体。
10.rnd1-23单抗单抗的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示：
11.dlvmtqtapsvpvtpgesvsiscrstclgiviyydyalywflqrpgqspqlliylnsnlasgvpdrfsgsgsgtaftlrisrveaedvgvyycefyymqdedfgsgtkleik
12.重链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示：
13.vkpggslklscaascgndlrpimswvrqtpdkrlewvaiglgmrewhyypdsvkgrftisrdqdkqtlylqmsslksedtamyycvdmehpyhvskwgqgttvtvs。
14.在一个实施方案中，本文提供了编码本发明任一实施方案的抗体的抗体重链和/或轻链可变区的分离的核酸。在一些方面，抗体的轻重链序列包含与seq id no:2和/或2至少85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％相同的氨基酸序列。
15.本发明制备的单克隆抗体具有较好的抑制rho gtp酶的活性，同时也具有较好的结合特异性，针对其他蛋白如bsa、白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等并不特异性结合。
16.具体的，相关方面包括单克隆抗体或其片段的变体，其包含一个或多个保守氨基酸取代，其中保留了与抗体或其片段与rho gtp酶1表位结合相关的功能活性。相关方面还包括包含一个或多个氨基酸插入或缺失的单克隆抗体的截短或融合变体，其中保留了与抗体或其片段与rho gtp酶1表位结合相关的功能活性。相关方面还包括包含保守氨基酸取代的一种或多种组合的变体，插入和缺失，特别是其中通过取代，插入或缺失而改变的残基的数目比亲本抗体分子少，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10，11-15，16-20和21-25个残基。相关
方面还包括具有一个或多个氨基酸残基或多肽结构域的较大插入或缺失的分子，其不改变抗体与靶分子中所需表位的功能结合活性。
17.本发明一方面提供一种干细胞促增殖无血清培养基，所述无血清培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分组成，所述基础培养基为dmem/f12培养基，所述添加成分为l-谷氨酰胺、非必须氨基酸、l-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bfgf、tgf-β1、pdgf-bb、辅酶a、丙酮酸钠和egf以及rnd1-23单克隆抗体；其中，l-谷氨酰胺的浓度为1-2mm，非必须氨基酸的浓度为1-2mm，l-抗坏血酸的浓度为40-60mg/l，亚硒酸钠的浓度为10-18μg/l，纤连蛋白的浓度为15-30mg/l，乙醇胺的浓度为1-4mg/l，氢化可的松的浓度为7-15mg/l，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1-1.5mg/l，人转铁蛋白的浓度为7-15mg/l，人胰岛素的浓度为10-15mg/l，bfgf的浓度为20-30μg/l，tgf-β1的浓度为3-7μg/l，pdgf-bb的浓度为7-15μg/l，辅酶a的浓度为80-120mg/l，丙酮酸钠的浓度为1-5mm，egf的浓度为5-20μg/l，rnd1-23单克隆抗体的浓度为10-100mg/l。
18.另一方面涉及包含任何上述抗体的组合物，包括包含至少一种靶向rho gtp酶的抗体和一种或多种药物赋形剂的组合物。
19.本公开中考虑的其它类型的抗体是那些主要用于体外的抗体，其中抗体与二级结合配体和/或与酶(酶标记物)连接，所述酶在与显色底物接触时将产生有色产物。合适的酶的例子包括脲酶，碱性磷酸酶，(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体是生物素和亲和素以及链霉亲和素化合物。
20.还考虑使用不改变抗体结合位点的反应条件，通过选择性地在免疫球蛋白的fc区引入巯基来衍生免疫球蛋白。公开了根据该方法制备的抗体缀合物，以显示改进的寿命，特异性和敏感性。效应子或报道分子的位点特异性连接，其中报道分子或效应子分子与fc区中的碳水化合物残基缀合也已在文献中公开。据报道，该方法可产生诊断和治疗上有希望的抗体，这些抗体目前处于临床评估中。
21.另一方面涉及一种治疗哺乳动物个体癌症的方法，包括给予有需要的个体足以治疗癌症的上述抗体量。相关方面包括其中所述哺乳动物受试者选自人，非人灵长类动物，犬，猫，牛，马和猪受试者的方法。优选方面涉及一种方法，其中所述哺乳动物受试者是人类受试者。
22.相关方面还包括上述方法，其中所述癌症选自结直肠癌，肝癌，肝细胞癌和胆管癌，胰腺癌，胃癌，结肠癌，肾癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，人乳头瘤病毒感染继发的头颈癌，前列腺癌，脑癌，多种形式的胶质母细胞瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和骨髓母细胞瘤以及骨肉瘤。
23.对rho gtp酶具有直接活性的抗体应当可用于发现和开发用于治疗各种癌症的治疗性药物产品。这些疾病包括结直肠癌，肝癌，如肝细胞癌和胆管癌，胰腺癌，胃癌，结肠癌，肾癌，非小细胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，人乳头瘤病毒感染继发的头颈癌，前列腺癌，各种类型的脑癌，包括成胶质细胞瘤多种形式，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和骨髓母细胞瘤，以及骨肉瘤。
24.有益效果
25.本发明特异性的提供了一种针对rho gtp酶的单克隆抗体，所述抗体能够特异性
的抑制rho gtp酶的活性，进而调控下游rock1蛋白的表达，该抗体能够促进干细胞的增殖，同时还能够抑制癌细胞的侵袭和迁移能力，具有很好的应用价值。
附图说明
26.图1单抗促进脂肪间充质干细胞增殖结果图
27.图2单抗降低ls513人结直肠癌细胞的迁移能力效果图
28.图3单抗降低ls513人结直肠癌细胞的侵袭能力效果图
29.图4单抗调控下游rock 1的相对表达量结果图
具体实施方式
30.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1 rho gtp酶单克隆抗体的制备
32.以rho gtp酶1(rnd1)作为免疫原(上海禾午巴西vs瑞士让球有限公司。2020年5月购买)。
33.以rho gtp酶1为免疫原，与5倍稀释的montanide
tm
gel 01st聚合物佐剂等体积混合，经皮下多点注射免疫balb/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔2周，剂量为100μg/只。三免后7d用不加佐剂的免疫原冲击免疫，每次免疫后7d，采血用间接elisa法检测抗体水平。4d后取效价最高的小鼠脾细胞进行融合。
34.将sp2/0细胞与脾细胞在peg1500作用下融合，融合后使用dmem培养基(dmem干粉13.5g/l，nahco
3 3.7g/l，l-谷氨酰胺0.2g/l)加入hat及ht进行换液。待杂交瘤细胞生长至底面积1/3左右，吸取上清液，用间接elisa方法测定其抗体效价。选择测定为强阳性的孔进行亚克隆筛选，获得能够分泌抗rho gtp酶抗体的高活性杂交瘤细胞株2株，rnd1-5和rnd1-23。
35.收集杂交瘤细胞rnd1-5和rnd1-23的培养液上清，使用小鼠ig类/亚类鉴定试剂盒测定单克隆抗体亚型，2株分泌的抗rho gtp酶单克隆抗体的类型都为igg1型，轻链为κ链。
36.2株单克隆抗体的制备：在致敏小鼠腹部注射1
×
106个杂交瘤细胞后，观察到小鼠腹部明显隆起，收集腹水离心后的上清，进行间接elisa效价测定，2株单抗的效价分别为rnd1-5为1:256000以及rnd1-23为1:512000。将腹水单克隆抗体经硫酸铵盐析法粗提后再用protein g进一步提纯，将2个单抗浓度分别都调整为10mg/ml备用。
37.通过本领域常规的解离常数测定方法，得到rnd1-23单抗亲和力解离常数(kd)为5.17
×
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，属于高亲和力抗体。
38.利用pcr方法扩增抗体轻重链序列通过测序鉴定得到rnd1-23单抗单抗的轻重链序列分别如下：
39.轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.1所示：
40.dlvmtqtapsvpvtpgesvsiscrstclgiviyydyalywflqrpgqspqlliylnsnlasgvpdrfsgsgsgtaftlrisrveaedvgvyycefyymqdedfgsgtkleik
41.重链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示：
42.vkpggslklscaascgndlrpimswvrqtpdkrlewvaiglgmrewhyypdsvkgrftisrdqdkqtlylqmsslksedtamyycvdmehpyhvskwgqgttvtvs
43.实施例2干细胞促增殖无血清培养基的制备
44.所述无血清培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分组成，所述基础培养基为dmem/f12培养基，所述添加成分为l-谷氨酰胺、非必须氨基酸、l-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bfgf、tgf-β1、pdgf-bb、辅酶a、丙酮酸钠和egf以及rnd1-23单克隆抗体；其中，l-谷氨酰胺的浓度为2mm，非必须氨基酸的浓度为2mm，l-抗坏血酸的浓度为50mg/l，亚硒酸钠的浓度为10μg/l，纤连蛋白的浓度为20mg/l，乙醇胺的浓度为2mg/l，氢化可的松的浓度为10mg/l，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1mg/l，人转铁蛋白的浓度为10mg/l，人胰岛素的浓度为10mg/l，bfgf的浓度为20μg/l，tgf-β1的浓度为5μg/l，pdgf-bb的浓度为10μg/l，辅酶a的浓度为100mg/l，丙酮酸钠的浓度为4mm，egf的浓度为10μg/l，rnd1-23单克隆抗体的浓度为1、10、100、200mg/l。
45.其中，dmem/f12培养基、非必须氨基酸和丙酮酸钠购买自gibco，货号分别是11330-032/11140-050/11360070；l-谷氨酰胺、l-抗坏血酸、亚硒酸钠、胰蛋白酶抑制剂、氢化可的松、乙醇胺、人转铁蛋白、辅酶a购买自sigma，货号分别是g3126、a4403、s5261、t6522、h0888、e0135、t0665、c4282，纤连蛋白、egf购买自hzbscience，货号分别是zy037bo011以及zy560ca011，人胰岛素购买自北京沃凯巴西vs瑞士让球有限公司，货号d11080，bfgf购买自wolcavi，货号tl-401，pdgf-bb购买自peprotech，货号:100-14b，tgf-β1购买自biovision，货号k4342-100。
46.实施例3干细胞促增殖无血清培养基对照组的制备
47.所述无血清培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分组成，所述基础培养基为dmem/f12培养基，所述添加成分为l-谷氨酰胺、非必须氨基酸、l-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bfgf、tgf-β1、pdgf-bb、辅酶a、丙酮酸钠和egf；其中，l-谷氨酰胺的浓度为2mm，非必须氨基酸的浓度为2mm，l-抗坏血酸的浓度为50mg/l，亚硒酸钠的浓度为10μg/l，纤连蛋白的浓度为20mg/l，乙醇胺的浓度为2mg/l，氢化可的松的浓度为10mg/l，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1mg/l，人转铁蛋白的浓度为10mg/l，人胰岛素的浓度为10mg/l，bfgf的浓度为20μg/l，tgf-β1的浓度为5μg/l，pdgf-bb的浓度为10μg/l，辅酶a的浓度为100mg/l，丙酮酸钠的浓度为4mm，egf的浓度为10μg/l。
48.其中，dmem/f12培养基、非必须氨基酸和丙酮酸钠购买自gibco，货号分别是11330-032/11140-050/11360070；l-谷氨酰胺、l-抗坏血酸、亚硒酸钠、胰蛋白酶抑制剂、氢化可的松、乙醇胺、人转铁蛋白、辅酶a购买自sigma，货号分别是g3126、a4403、s5261、t6522、h0888、e0135、t0665、c4282，纤连蛋白、egf购买自hzbscience，货号分别是zy037bo011以及zy560ca011，人胰岛素购买自北京沃凯巴西vs瑞士让球有限公司，货号d11080，bfgf购买自wolcavi，货号tl-401，pdgf-bb购买自peprotech，货号:100-14b，tgf-β1购买自biovision，货号k4342-100。
49.实施例4rnd1-23单抗无血清培养基对脂肪间充质干细胞增殖的影响
50.脂肪间充质干细胞来自(货号：htx2309，深圳市豪地华拓巴西vs瑞士让球有限公司)。
51.将质量浓度0.2％的明胶溶液，加入到待包被的培养皿中，37℃孵育1小时，得到预包被明胶的培养皿。在孵育过程中避免基质干掉，使用时弃掉基质接种细胞即可。按照接种密度为5.0
×
103/cm2个活细胞/cm2将脂肪间充质干细胞接种于预包被明胶的培养皿中，分别加入实施例2和3提供的无血清培养基，放入培养箱(37℃，5％co2)中进行培养，96小时后去培养液，每孔加入20μl mtt溶液，恒温孵箱孵育4h，终止培养，去净mtt溶液，每孔加入150μl dmso，震荡10min，使结晶充分溶解，于酶联免疫检测仪490nm波长检测各孔a值，结果如图1所示。
52.从图1的结果可以看出，相对于不加rnd1-23单克隆抗体的空白对照组，加入了rnd1-23单抗之后，能够显著的提高脂肪间充质干细胞增殖效率，差异显著(p《0.05)，并且呈现浓度剂量正相关的关系，在浓度为200mg/l也就是200ug/ml的条件下，aod490达到了3.02
±
0.10。
53.实施例5rnd1-23单克隆抗体对结直肠癌细胞的影响及下游信号rock的的影响
54.将ls513人结直肠癌细胞(货号cl-0640，procell)接种于10％胎牛血清的dmem完全培养基中，置于37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养，每3天更换培养基，扩大培养得到实验细胞。
55.(1)将transwell小室倒置，在膜的下表面涂一层纤维粘连蛋白(400μg/ml，10μl)，37℃下作用2h，pbs洗一遍后放入预先每孔加入600μl于10％胎牛血清的dmem完全培养基的24孔板内。ls513细胞胰酶消化后用无血清dmem完全培养基调整细胞浓度为1
×
106/ml，每个transwell内室加入细胞悬液100μl，分为对照组和不同实验组，具体如下：
56.空白对照组：不加入rnd1-23单克隆抗体；
57.单抗组1：加入终浓度为1μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
58.单抗组2：加入终浓度为10μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
59.单抗组3：加入终浓度为100μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
60.单抗组4：加入终浓度为200μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
61.阳性对照组：加入100μg/ml的y-27632；
62.37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养18h后取出transwell小室，用棉签擦去膜内室面的细胞，另一面吹干后结晶紫染色20min，用清水洗3次，显微镜下观察细胞，计数。结果如图2所示。
63.从图2的结果可以看出，空白对照组中小室下表面的细胞数平均为181
±
9.5，单抗组和阳性对照组与空白对照组相比，差异有统计学意义(p《0.05)。同时，单抗组4也就是终浓度为200μg/ml的rnd1-23单克隆抗体时细胞数只有40
±
3.0，可以明显降低ls513人结直肠癌细胞的迁移能力。
64.(2)将matrigel 1:3稀释后包被transwell小室底部膜的上室面，膜外面涂10μl 400μg/ml的纤维粘连蛋白，置于37℃下使其凝固，用无血清培养基洗matrigel一次。然后将细胞胰酶消化后用无血清培养基调浓度为1
×
106/ml，每个transwell内室加入细胞悬液100μl，分为对照组和不同实验组，具体如下：
65.空白对照组：不加入rnd1-23单克隆抗体；
66.单抗组1：加入终浓度为1μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
67.单抗组2：加入终浓度为10μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
68.单抗组3：加入终浓度为100μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
69.单抗组4：加入终浓度为200μg/ml的rnd1-23单克隆抗体；
70.阳性对照组：加入100μg/ml的y-27632；
71.放入已加入600μl含10％fbs的dmem完全培养基的24孔板内，37℃，5％co2饱和湿度培养箱中培养20h后，用棉签擦去膜内室面的matrigel和细胞，另一面吹干后结晶紫染色20min，用清水洗3次，显微镜下观察细胞，计数。结果如图3所示。
72.由于matrigel能在聚碳酸滤膜表面形成类似天然基底膜的结构，细胞侵袭穿过matrigel的能力反映该细胞的侵袭能力，通过计数进入小室下表面的细胞数越多则细胞的侵袭能力越大。从图3的结果可以看出，随着单抗浓度的增加，抑制侵袭能力的效果越好。在单抗组4也就是终浓度为200μg/ml的rnd1-23单克隆抗体时穿过膜细胞数只有36
±
3.0，可以明显降低ls513人结直肠癌细胞的侵袭能力。
73.(3)取(2)中各组培养后的细胞，采用trizol一步法提取中rna，取2μg总rna行反转录，pcr扩增rock 1和gapdh。具体引物序列为：rock1上游：5
’‑
gaagaaagagaagctcgagaagaagg-3’,下游：5
’‑
atcttgtagctcccgcatctgt-3’；gapdh上游：5
’‑
gaaggtgaaggtcggagtc-3’，下游：5
’‑
gaagatggtgatgggatttc-3’,扩增的pcr条件为，预变性95℃5min，变性94℃30s，退火58℃1min，延伸72℃1min 30个循环，终末延伸72℃10min。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统摄像，以gapdh的表达量为基础，计算rock1的相对表达量，结果如图4所示。
74.从图4的结果可以看出，本发明的rnd1-23单克隆抗体能够通过抑制rho gtp酶1(rnd1)本身的活性来调控下游rock 1的活性，在浓度为200μg/ml时rock1只有0.19
±
0.01，比空白对照组的1.1
±
0.09有显著的抑制效果。
75.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。