转基因动物及其产品检测技术研究进展

作者：杨超月

专论综述 | 转基因动物及其产品检测技术研究进展

2020-12-24 17:26 来源:中国兽医发布

原标题：专论综述 | 转基因动物及其产品检测技术研究进展

摘要：为探索可靠、灵敏的转基因动物及其产品检测技术，从核酸检测和蛋白检测两个方面，综述了转基因动物及其产品不同检测技术的原理、特点及应用，提出了每种检测技术的不足及今后转基因检测技术的发展趋势和研究方向。目前，已经研发的核酸检测技术主要包括多种PCR方法、环介导等温扩增技术、Southern blot技术和染色体原位杂交技术等，蛋白检测方法主要包括酶联免疫吸附检测技术、免疫层析试纸条、Western blot技术、免疫组织化学和免疫荧光技术等。三代测序技术是近年来提出的一种新型基因检测技术，适用于对未知序列转基因动物的分析。随着转基因技术的发展，转基因动物及其产品越来越多，高通量、高灵敏度和低成本的检测技术将成为未来转基因动物及其产品检测的研究重点。

随着转基因产品在理论和技术上的不断完善，越来越多的转基因动物及其产品被批准上市，逐渐走进人们的生活。美国GTC公司生产的用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物重组人抗凝血酶Ⅲ（ATryn），分别在2006年和2009年被欧盟和美国食品药品管理局（FDA）批准上市；2010年10月，荷兰Pharming公司生产的从转基因兔奶中纯化的一种人重组C1酯酶抑制剂（Ruconest）获得欧洲药品管理局（EMA）批准生产；2015年11月，美国FDA将转生长激素基因三文鱼送上人们的餐桌。

转基因动物及其产品的主要优势表现在提高动物生产性能、增强抗病能力、加快培育新品种，以及有利于建立疾病模型、生产医疗药品和营养保健品、移植器官、保护环境等方面。目前，世界各国相继建立了转基因标识制度，公众对转基因产品安全的关注度也不断提高，因此在进出口检疫结果互认、农贸市场食品安全监管以及消除贸易壁垒等方面，需要可靠、灵敏的转基因检测技术。为帮助建立高通量、高灵敏度和低成本的转基因动物及其产品检测技术，从核酸和蛋白质检测两个方面，对当前主要的转基因动物及其产品检测方法进行综述。

核酸检测方法

定性PCR技术

PCR技术是目前应用最广的检测技术。根据检测靶序列不同，PCR检测技术分为筛查法、基因特异性法、构建特异性法和转化体特异性法4类。

筛查法。该方法根据启动子、终止子、标记基因及报告基因序列设计引物进行PCR扩增。在动物及其产品检测中，最常用的基因包括，绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），红色荧光蛋白和新霉素磷酸基转移酶II（neomycin phosphotransferase II，NTP II）编码基因以及新霉素抗性基因（neomycin resistance gene，neoR）等。Huang等根据抗性基因neoR序列设计引物，通过实时定量PCR方法确定了转基因细胞重组效率；Chen等利用慢病毒载体制备了DsRed1和Venus双转基因，根据红色荧光蛋白编码基因序列设计了长度为695 bp的引物，并对转基因猪进行了确认。由于某些基因在自然环境中广泛存在，使转基因产品在检测过程中易受到污染，从而出现假阳性结果，所以该方法特异性较差。但在大规模样品筛查时，通用检测元件能节省时间，减少工作量，提高效率，所以该方法适合于转基因动物及其产品的初步筛查。

基因特异性法。基因特异性法是以目的基因作为检测靶标，在实际操作过程中，能够获取远远大于启动子和终止子数量的基因数量，因而比筛查法更具特异性。Huang等针对猪β-防御素2（porcine beta-defensin-2，PBD-2）基因设计引物，确定了使用CRISPR/Cas9和Cre/loxP系统生成无标记的转PBD-2基因猪中PBD-2的相对mRNA表达水平；Chen等在检测双转基因猪时，针对DsRed1和Venus基因分别设计1对特异性引物，通过PCR和RT-PCR方法分别在新生的11头仔猪和10种器官中检测到了这两种基因；Cui等通过体细胞核转移技术生产了hLF和hLZ双转基因猪，分别针对hLF和hLZ基因设计了3对和1对引物，用于鉴定hLF和hLZ双转基因猪。

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构建特异性法。该方法将引物设计在转化载体中具有完整表达目的基因能力的基因盒上，相较前两种方法具有更高的特异性。但对于具有相同外源基因的转基因动物，当选用相同质粒进行转化后，用此种方法则无法鉴定。Huang等从转基因猪后代猪耳组织中提取基因组DNA，根据转基因靶向插入片段等设计了4对引物，对无标记的转基因猪进行了进一步确认；Chen等采集耳朵和尾巴以及静脉血，根据慢病毒载体重组序列中EF-1启动子设计引物，对转基因猪进行了确认。