浅谈无血清培养基开发历史和现状

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

浅谈无血清培养基开发历史和现状

动物细胞培养有着极其广阔的应用市场：（一）细胞可以作为“工厂”来生产治疗性重组蛋白抗体药物、人用和兽用疫苗等；（二）细胞本身也可以作为“终产品”：比如免疫细胞治疗和干细胞培养；（三）细胞培养也广泛用于基础研究领域（包括各种生物活性分析、细胞内和细胞间信号传导机理的研究等）。作为细胞生长的环境和营养来源，培养基的性能很大程度上决定了细胞密度和表达产物的产量及质量，因此培养基是工艺开发最重要的环节之一。本文将简要回顾过去60年无血清培养基（Serum-free Medium，SFM）开发历程，回望几代科学家对于培养基配方开发的不懈努力，进而粗浅地聊聊国际和国内培养基开发的现状。

虽然动物细胞体外维持培养的研究可以追溯到20世纪初甚至更早，培养基配方开发划时代的里程碑当属Harry Eagle博士分别于1955年和1959年在《科学》杂志上发表的两篇研究文章，1955年Eagle博士发布细胞基础培养基配方，并指出培养基是“一个包含无机盐、氨基酸、糖、维生素及其它必须营养物的等渗透压且具有pH缓冲能力的混合物”。Eagle在1959年的文章中提出了进一步改进的配方，并将该配方命名为“Minimal Essential Medium (MEM)”。MEM配方需要在10%以上牛血清浓度下才能支持细胞生长，这一配方即使在60年后的今天MEM培养基仍然被用于研究领域和一些疫苗生产工艺里，Eagle的研究工作无疑奠定了近代无血清培养基开发的基础。有趣的是在Eagle发明MEM配方同期出现了另一个里程碑式的成果：1957年科罗拉多大学医学系教授Dr. Theodore T. Puck从中国仓鼠分离出卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）进行体外连续传代培养。统计数据表明当今70%以上的重组蛋白和抗体药物是通过CHO细胞表达的，目前在临床中和临床前研究的新大分子药物通过CHO细胞表达的占比更高，相信Puck当时肯定没有料到半个世纪后CHO细胞会有如此广阔的应用和深远的贡献。

在上世纪60年代的培养基配方都需要添加10%甚至更高浓度的血清才能支持细胞贴壁生长，无血清培养基开发可以分为两个研究方向推进：一条路线是寻找能替代血清支持细胞在体外扩增的营养成分。血清含有上千种不同成分，为细胞体外培养提供广泛而丰富的营养和各种细胞因子，但动物血清的使用存在引进外源病毒的风险，因此减少血清浓度甚至完全去除血清对细胞培养有着重大的意义；另一条路线则更加重视优化配方中营养物成分和浓度实现细胞的高密度培养，需要指出血清的添加未必能提高细胞密度，科学家通过研究培养基中营养成分消耗，发现提高氨基酸和维生素的浓度可以提高细胞最高密度。上述两条路径又是有交叉的，沿着两条路径科学家们在60-80年代间研发出许多不同系列的培养基配方：Dulbecco和Freeman于1959年发表了改进版的MEM配方Dulbecco’s MEM （DMEM）；1984年Iscove又在DMEM基础上进一步改进推出了IMEM配方；Moore等人1967年推出RPMI（Roswell Park Medical Institute）系列配方，RPMI在维持无机盐浓度的前提下提高了氨基酸维生素等成分的浓度；1965年和1984年Richard Ham博士发布了F-10和F-12系列培养基；Charity Waymouth博士1984年研发了MCDB系列配方。除了众多学术界的研究，在60年代也诞生了三个老牌培养基公司：GIBCO（Grand Island Biological Company）在纽约州Grand Island成立；JRH Biosciences公司在澳大利亚成立；HyClone在犹他州Logan成立。这些品牌在无血清培养基研究方面也作出了卓著的贡献。

培养基配方开发方法有多种，无法在此一一道来。其中通过研究营养成分的消耗来确定添加的量是常用的方法，但受限于分析能力和不确定的血清存在，能够定量分析的培养基成分不多；培养基混合也是常用的策略，并且通过和实验设计方法（Design of Experiment, DoE）结合提高培养基混合实验的效率。培养基混合优化配方最值得一提的是Gordon Sato博士和他的合作者1979年发表的将DMEM和F-12按照1:1的体积比混合得到的DMEM/F12培养基配方，DMEM/F12综合了两个大相径庭配方的优势，提高了细胞培养的密度。尽管在当时有许多培养基混合配方的尝试，DMEM/F12混合培养基应该是最为成功的，也成为后期许多无血清培养基配方开发的新起点。