细胞养不好？这些注意事项请收好

作者：张馨予

养细胞是一件戳心戳肺的事。你要像照顾小孩一样仔细对待，爱护她，呵护她。如果你照顾的时候能注意这些问题，会让你的细胞养的更好。下面就将养细胞的注意事项跟大家交流一下。

1. 冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管的爆裂。

2. 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？

除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有 10～15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

3. 可否使用与原先培养条件不同的培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。

4. 可否使用与原先培养条件不同的血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5. 何谓 FBS，FCS，CS，HS？

FBS（fetal bovine serum）和 FCS（fetal calf serum）是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 是错误的使用字眼，请不要再使用。CS（calf serum）则是指小牛血清。HS（horseserum）则是指马血清。

6. 培养细胞时应使用 5% 或 10% CO2？或根本没有影响？

一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统，而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时，细胞培养时应使用 10% CO2；当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时，则应使用 5% CO2 培养细胞。

7. 何时须更换培养基？培养基中是否须添加抗生素？

视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上的更换时间，按时更换培养基即可。

除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。

8. 附着性细胞继代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为 0.05% trypsin-0.53 mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 –20 ℃，避免反复冷冻解冻造成 trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会。

9. 悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部分含细胞的培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

10. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞，其离心速率一般为 1 000 rpm，5～10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。

11. 细胞的接种密度为何？

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。

12. 细胞冷冻培养基的成分为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含 5～10% DMSO（dimethyl sulfoxide）和 90～95 % 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将 DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。

13. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？

冷冻保存使用的 DMSO 等级，必须为 Tissue culture grade 的 DMSO（如 Sigma D2650），其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于 4 ℃，避免反复冷冻解冻造成 DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤 DMSO，则须使用耐 DMSO 的 Nylon 材质滤膜。

14. 冷冻保存细胞的方法？欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻保存方法一：冷冻管置于 4 ℃ 30～60 分钟 →（-20 ℃ 30 分钟）→ -80 ℃ 16～18 小时（或隔夜）→ 液氮槽 vapor phase 长期储存。

冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1～3 ℃ 至 –80 ℃ 以下，再放入液氮槽 vapor phase 长期储存。–20 ℃ 不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。

冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。

15. 如何避免细胞污染？发生微生物污染时应如何处理？