基因治疗时代到来：常用基因治疗载体的介绍与选择

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

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基因治疗载体分为两大类：病毒载体（主要包括慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒等），非病毒载体（主要包括裸露DNA、脂质体、纳米载体等）

在讲基因治疗载体前，我们先讲一下基因治疗中的两个概念：in vivo和ex vivo。

in vivo：活体直接转移，将带有遗传物质的载体直接注射到实验动物或人体内。适用载体：腺相关病毒、腺病毒、非病毒载体等。

ex vivo：在体转移，将实验对象的细胞取出，体外培养并导入重组基因，而后将这些经遗传修饰的细胞重新输回实验动物体内。适用载体：慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等。

接下来我们介绍以下常用的基因治疗载体

基因治疗中的病毒载体

逆转录病毒（RV）：单链RNA病毒，可高效地感染多种类型细胞，可以将外源基因随机插入并稳定整合到宿主细胞基因组中持续表达。其中γ-逆转录病毒载体最早被改造的且广泛地被应用到基因治疗中，并取得了不少巨大的成功。

不足之处：①不能感染非分裂细胞；②转录终止能力相对较弱，从而有可能造成转录通读；③可能产生有复制能力的病毒；④可能造成插入性突变，例如使用逆转录病毒载体治疗的10例X连锁重度复合型免疫缺陷病(X-SCID)患者中，有4例因载体整合在原癌基因LMO2等的附近，激活下游基因的表达而罹患白血病。

逆转录病毒的插入位点是随机的，但更偏向于插人基因的第一个内含子和转录起始位点。此后人们开始重新审视基因治疗载体的使用所带来的风险，此次使用逆转录病毒治疗JEB后，研究团队通过全基因测序确定了插入位点，发现有27000多个插入位点，但基本都集中在非编码序列，没有破坏已知的抑癌基因。

慢病毒（LV）：以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。属于逆转录病毒，能有效感染分裂细胞和非分裂细胞。随机插入并稳定整合到宿主细胞基因组中持续表达。一系列的临床研究效果非常理想，具有广阔的应用前景。

慢病毒因为也属于逆转录病毒，所以也存在因为随机插入造成基因突变的风险，但是一系列的临床研究证实，慢病毒载体相对于逆转录病毒来说安全性更高，适用性也更广。

腺病毒（AdV）：无包膜的线性双链DNA病毒，腺病毒载体宿主细胞范围广泛，有效感染分裂细胞和非分裂细胞，不与宿主细胞基因组整合，因而不存在插入突变风险，载体容量较大。

不足之处：①缺乏特异靶向性，在一些缺乏其相应受体的细胞中感染效率低；②目的基因的表达时间短，可能需要重复治疗；③有较强的免疫原性，例如18岁少年Jesse Gelsinger在接受Jim Wilson教授主导的腺病毒（AdV）的临床治疗中，因强烈的免疫反应去世（图4），此后Wilson教授找到了更适合更安全的用于基因治疗的病毒载体：腺相关病毒（AAV）。

腺相关病毒（AAV）：目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因治疗载体，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

不足之处：2018年1月29日，Human Gene Therapy杂志发表了美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院James.M.Wilson教授作为通讯作者的题为：Severe toxicity in nonhuman primates and piglets following high‐dose intravenous administration of an AAV vector expressing human SMN的研究文章（图5）。研究认为静脉高剂量注射AAV病毒用于基因治疗会有严重毒性。详情点击：过犹不及：最安全的基因治疗载体AAV被证实存在严重毒性作用

除了上述几种常用的病毒载体外，在临床基因治疗中还有牛痘病毒载体、痘病毒载体、单纯性疱疹病毒载体等，由于使用较少，不再一一介绍。

基因治疗中的非病毒载体

在临床基因治疗中，病毒载体存在潜在安全性问题，且病毒载体容量有限，这些缺点促进了非病毒载体系统的发展。非病毒载体具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高、外源基因长度不受限制等优点。最简单的非病毒载体是裸DNA，可直接注入特定的组织，特别是肌肉，能达到较高水平的基因表达，在临床基因治疗中裸DNA有着较为广泛的应用。以及近期异军突起的纳米材料载体，之前BioWorld专门做过解读，详情点击：CAR-T新策略：纳米颗粒携带CAR载体在体内产生CAR-T细胞。