酷！Cas9 不切DNA就可以编辑碱基失活基因

作者：张馨予

生物极客导读：

对于高拷贝的基因组而言，如果一旦用CRISPR进行切割，极有可能引发复杂的基因组重组等副反应。来自弗吉尼亚医学院的科学家们近期在Nature Methods发表文章，使用cas9偶联上碱基突变的BE3结构域，通过改变单个核苷酸来敲除基因以产生终止密码子，结果表明，这种被称为“CRISPR-STOP”方法是一种有效的、较不有害的替代野生型cas9的基因敲除研究。不仅如此，他们在早期在约7000个人类基因中引入终止密码子。 CRISPR-STOP介导的靶向筛选显示与WT cas9相当的功能，表明相应的方法对全基因组功能筛选的适用性。

酷！Cas9 不切DNA就可以编辑碱基失活基因

文章解读：

CRISPR技术的效率和简单性在基因敲除（KO）和功能基因组研究中呈现前所未有的功能。在目标位点，Cas9产生双链DNA断裂，进而由非同源末端连接（NHEJ）或同源性重组（HDR）机制修复。由于插入和缺失（indels）经常引起移码突变，NHEJ修复机制通常实现基因KO，因此可以实现相应基因功能研究。尽管NHEJ介导的基因沉默非常有效，但最近的研究已经提出了关于使用野生型（WT）Cas9方法进行双链DNA断裂影响的担忧。首先，系统引入无法控制的随机indel，并不是所有的indel都会导致基因KO，有些甚至可能为目标蛋白引入新的功能。其次，更重要的是，WT Cas9的双链DNA切割已显示导致过度的DNA损伤和细胞死亡，特别是在多拷贝基因组区域。这可能会混淆实验结论，因为致死性和降解型表型将与靶基因功能无关。在一项具有里程碑意义的研究中，Komor等人最近证实，APOBEC1酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂与切口酶Cas9（BE3）的融合有效地将胞嘧啶（C）转化成尿嘧啶（U或T） sgRNA的非结合链不引起双链DNA断裂或需要外源DNA模板。

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在这里，科学家们利用这个CRISPR-BE 来改变遗传密码并引入早期的密码子。将BE3靶向包含CGA（Arg），CAG（Gln）和CAA（Gln）的基因的编码链，以分别产生TGA，TAG或TAA终止密码子。类似地，通过将最后两个Gs中的任何G改变为A（或非编码序列中的C至T），编码链中的靶向TGG（Trp）产生TGA，TAG和TAA终止密码子（图1a）。为了测试方法的效率，我们在mCherry蛋白的前半部分确定了四个潜在的诱导型停止（i-stop）密码子。我们将靶向这些密码子的sgRNA与BE3基础编辑者或WT Cas9一起短暂转染到mCherry阳性HEK293T细胞中。为了测量KO效率，使用流式细胞术定量mCherry阴性细胞（mCherry KO）。在用BE3转染的细胞中，在四种sgRNA（sgRNA2，sgRNA3和sgRNA4）中有三种，观察到明显更多的mCherry阴性细胞。这些结果表明，BE3介导的无义突变是报告基因的有效基因沉默方法，尽管BE3蛋白复合物相对于WT Cas9的蛋白表达和/或转染效率略低。值得注意的是，导致BE3（> 35％的细胞）的最高数量的KOMP3和sgRNA4都以产生终止密码子的两个潜在Gs（目标链中的Cs）靶向Trp密码子。

为了证实观察到的KO效应是由于APOBEC1在BE3复合物中的密码子编辑催化活性，科学家们在APOBEC1的催化结构域中引入了先前鉴定的8个失活突变（P29F和E181Q）。如预期的那样，具有突变型APOBEC1的BE3复合物不产生mCherry阴性细胞。此外，与WT Cas9不同，引导BE3与sgRNAs产生同义突变（基本编辑而不改变密码子）不会导致mCherry表达的丢失。目标DNA测序结果证实了在九个单细胞中的四个（g）引物序列的第四和第八个核苷酸之间的复合物的R环中的特异性C至T转变。替换率符合mCherry流式细胞术结果。最近的研究已经证明，当靶向高拷贝数基因组区域时，WT Cas9可能导致过度的DNA损伤和随后的细胞死亡或适应性降低。为了测试WT Cas9在含有高拷贝mCherry基因的细胞中可能是有害的假说，并且这可能是一个似乎合理的原因，为什么当用WT Cas9靶向时，我们观察到较少的mCherry阴性细胞，我们产生了含有可变的单细胞克隆mCherry基因的数量。我们在低（2n）和高拷贝数（> 12）mCherry阳性细胞克隆中测试了相同的四种sgRNA。在两种细胞系中，BE3比WT Cas9更有效地工作。