一种在生物反应器中连续培养I群禽腺病毒的方法

作者：张馨予

一种在生物反应器中连续培养i群禽腺病毒的方法
技术领域
1.本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种在生物反应器中连续培养i群禽腺病毒的方法。

背景技术：

2.i群禽腺病毒可引起鸡心包积液综合征及包涵体肝炎疾病的流行和扩散，能给禽类养殖业造成重大损失。i群禽腺病毒可被制备成灭活疫苗来实现上述禽类疾病的有效防控，目前，i群禽腺病毒的培养大多依靠来自发病鸡肝脏制备的组织，也有使用鸡胚通过卵黄囊接种、鸡胚原代肝细胞以及lmh细胞进行禽腺病毒培养的案例，但这些禽腺病毒培养工序繁琐、成本较高、原料来源受限，不能满足疫苗规模化生产需要，而且存在外源病毒污染的风险。大规模生物反应器细胞悬浮与病毒增殖技术是当代最先进的疫苗抗原生产工艺技术，其可利用lmh全悬浮细胞在生物反应器中增殖病毒，但是，生物反应器及其配套的生物反应器袋子均为一次性物品，袋子费用较高，目前只能一次性收毒，无法多次收毒。如果多次收毒，易出现污染等问题，且反应器运行参数要求严格控制，导致利用生物反应器繁毒成本较高，从而难以满足疫苗规模化生产需要。

技术实现要素：

3.为了克服上述缺陷，本发明提供了一种i群禽腺病毒的培养方法，能够实现i群禽腺病毒在生物反应器中连续多次收毒，从而实现i群禽腺病毒的工业化大规模生产，为i群禽腺病毒疫苗的制备提供广阔的原料来源。
4.本发明的技术方案如下：
5.一种在生物反应器中连续培养i群禽腺病毒的方法，步骤如下：
6.(1)第一次收毒
7.将全悬浮lmh细胞接种于生物反应器中培养，当lmh细胞数量达到4.0～6.0
×
106个/ml时，按moi值0.01～0.04接入种毒，静置吸附1h，按lmh细胞培养液体积比加入细胞维持液，继续培养，当细胞活率下降到85～90％时，按lmh细胞培养液体积比补加细胞悬液至生物反应器袋中继续培养，继续培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。
8.(2)第二次收毒
9.在完成第一次收毒后，向生物反应器袋中加入细胞悬液，按moi值0.005～0.02补加种毒，静置吸附1h，按lmh细胞培养液体积比加入细胞维持液，继续至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。
10.(3)第三次收毒
11.在完成第二次收毒后，向生物反应器袋中加入细胞悬液，按moi值0.005～0.02补加种毒，静置吸附1h，按lmh细胞培养液体积比加入细胞维持液，继续培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。在本次病毒液收获后，终止病毒培
养。
12.上述连续培养i群禽腺病毒的方法中，全悬浮lmh细胞由如下方法制备而成：
13.将lmh贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化分散，并进行有限稀释法克隆lmh细胞。将消化细胞使用含10％胎牛血清的dme/f12(1:1)培养基稀释至5～10个/ml，并加到96孔细胞培养板中，每孔加0.1ml(即0.5～1个细胞/孔)，放置37℃，5％co2培养箱培养7d后，取出观察，选择单克隆生长孔，将生长良好的细胞转移到24孔板再做克隆，培养至密度为2～3
×
107个/ml，进行消化分散。将消化细胞接种至jsbio tm lmh sfm无血清培养基上，每24h取样计数，直至培养72h。待细胞活率低于85％、细胞倍增时间大于48h时，800rpm/min离心5min，弃掉上清液，使用无血清培养基调整细胞密度至1.5～2.0
×
106个/ml后继续培养至72h；重复这一培养过程，直至每72h正常稀释传代，连续10代保持48h时活细胞密度倍增且72h时细胞密度为起始密度的4.5～6.5倍，细胞活率高于95％，得到lmh全悬浮细胞。对驯化好的lmh全悬浮细胞进行液氮冻存保存。
14.其中，lmh贴壁细胞复苏过程如下：
15.将含有lmh贴壁细胞的冻存管于37℃恒温水浴锅中摇晃使之溶化，然后用75％酒精擦拭冻存管，置于超净工作台，用1ml移液枪将细胞悬液移入到装有10ml培养基的离心管中，800rpm/min离心5min，弃上清，重新加入10ml的培养基，混匀细胞后置于培养箱(37℃，5％co2)内培养。
16.其中，消化分散的具体步骤为：
17.弃去旧培养基，加入8ml无菌pbs清洗两次，然后加入1ml胰酶，轻轻摇晃，使所有细胞都沾染上胰酶，来回摇晃5～10次，弃去胰酶，用含10％胎牛血清的dme/f12(1:1)培养基终止消化，轻轻吹打均匀细胞。
18.上述连续培养i群禽腺病毒的方法中，全悬浮lmh细胞在生物反应器中的培养条件为：温度为30～37℃，ph为6.9～7.5，do控制在70～100％，转速40rpm/min。
19.上述连续培养i群禽腺病毒的方法中，细胞维持液选自细胞培养液jsbio tm cd eb66488。
20.上述连续培养i群禽腺病毒的方法中，在加入细胞维持液后，继续培养的条件为：温度为30～37℃，ph为6.9～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min。
21.上述连续培养i群禽腺病毒的方法中，生物反应器中lmh细胞培养液与所加入的细胞维持液的体积比选自1:1～1:3；生物反应器中lmh细胞培养液与细胞悬液的体积比选自1:1～1:3。
22.上述连续培养i群禽腺病毒的方法中，细胞悬液选自密度为8.0～12.0
×
106个/ml，且在48～60h的培养时间之内达到该细胞密度的细胞悬液。超过60h的培养时间，代谢产物增多，营养物质耗尽，细胞容易进入衰亡期，不再适合病毒的接种和培养。
23.细胞悬液由如下方法制备而成：
24.从液氮中迅速取出lmh全悬浮细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待lmh全悬浮细胞完全融化后，在复苏细胞中加入约20倍体积的jsbio tm lmh sfm无血清培养基，经800rpm/min离心5min，倒掉上清液，加入jsbio tm lmh sfm无血清培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至125ml摇瓶中，并放置于装载轨道摇床(摇床速度为150rpm/min)的5％co2、37℃培养箱上进行悬浮培养，扩大培养至一定规模后，接种至生物反应器中培养，调节细胞初始密度为3
～5
×
106个/ml，待培养至48～60h时，收获细胞悬液，此时细胞密度为8.0～12.0
×
106个/ml。
25.在本发明中，种毒是由如下方法制备而成：
26.将i群禽腺病毒接种于全悬浮lmh细胞液，放置于37℃、5％co2培养箱静置1h，加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，全悬浮lmh细胞液与细胞维持液的体积比为1:1～1:3，在30～37℃条件下，继续培养30～48h，待细胞活率降至85～90％，静置沉降后弃去1/3～1/2的上清，并补加相同体积的细胞维持液，继续培养16～24h后收毒。将收集的病毒液重复上述接种收毒步骤，直至tcid
50
≥10
8.5
/0.1ml，将最后一次收获的悬浮毒作为种毒。
27.上述培养方法获得的i群禽腺病毒，可用于禽疫苗的制备。所述禽疫苗为包括抗原灭活疫苗。
28.本发明还提供了一种禽疫苗，其有效成分为经灭活的利用上述培养方法得到的i群禽腺病毒。
29.本发明还提供了一种上述禽疫苗的制备方法，是将上述培养方法得到的i群禽腺病毒灭活后，作为抗原，制备禽疫苗，具体步骤如下：
30.(1)灭活
31.向i群禽腺病毒液中加入甲醛溶液，使病毒液中甲醛终浓度为0.1％，置于37℃恒温摇床中，摇振灭活20h，灭活后的病毒液置2～8℃保存；
32.(2)半成品检验
33.无菌检验：取灭活的禽腺病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验；
34.灭活检验：将长成单层的lmh细胞培养液弃去，用pbs(0.01mol/l，ph值7.4)清洗3次，加入含2％胎牛血清的dme/f12培养液，将腺病毒灭活病毒液按体积0.1％的量接种于长成良好单层的lmh细胞中，置于37℃、5％co2培养箱中培养7d，将无细胞病变效应的病毒液盲传2代，观察每代培养物的细胞病变效应，若均无细胞病变效应出现，则证明病毒液灭活完全；
35.(3)灭活疫苗制备
36.取注射用白油94份，加2％硬脂酸铝，加热，边加边搅拌，直至完全透明为止，再加入6份司本-80，混合后，高压灭菌，获得油相；取灭活的腺病毒病毒液加入高压灭菌的吐温80，使吐温80占总体积的4％，混匀，获得水相；将2份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速混匀，然后3600rpm/min，乳化30min，获得疫苗。
37.本发明的有益效果为：
38.本发明的lmh细胞全悬浮培养方法，在全悬浮培养72h后，细胞活率不低于95％，细胞数可达到108个/ml。接种病毒时可根据合适的moi值计算种毒的添加量，精确控制每批次的生产，实现批间稳定。可连续收获2～3次；收获的病毒液其病毒滴度(tcid
50
)可达10
8.0
～10
9.0
/0.1ml，是传统方法的300倍以上。本发明生产工艺简单且稳定、易操作，可以大量降低生产成本，而且生产周期短、病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。
附图说明
39.图1为全悬浮lmh细胞图。
具体实施方式
40.本发明具体实施方式所需的全悬浮lmh细胞、细胞悬液以及i群禽腺病毒4型种毒，由以下方法实现制备，其中，全悬浮lmh细胞也可由商业渠道获得，i群禽腺病毒4型来源于青岛中仁澳兰生物工程有限公司研发中心。
41.(1)全悬浮lmh细胞的制备
42.将lmh贴壁细胞复苏，选择汇合度大于80％的贴壁细胞消化分散，并进行有限稀释法克隆lmh细胞。将消化细胞使用含10％胎牛血清的dme/f12(1:1)培养基稀释至5～10cells/ml，并加到96孔细胞培养板中，每孔加0.1ml(即0.5～1个细胞/孔)，放置37℃，5％co2培养箱培养7d后，取出观察，选择单克隆生长孔，将生长良好的细胞转移到24孔板再做克隆，培养至密度为2～3
×
107cells/ml，进行消化分散。将消化细胞接种至jsbio tm lmh sfm无血清培养基上，每24h取样计数，直至培养72h。待细胞活率低于85％、细胞倍增时间大于48h时，800rpm/min离心5min，弃掉上清液，使用无血清培养基调整细胞密度至1.5～2.0
×
106cells/ml后继续培养至72h；重复这一培养过程，直至每72h正常稀释传代，连续10代保持48h时活细胞密度倍增且72h时细胞密度为起始密度的4.5～6.5倍，细胞活率高于95％，得到lmh全悬浮细胞。对驯化好的lmh全悬浮细胞进行液氮冻存保存。由上述方法制备的全悬浮细胞如图1所示。
43.其中，lmh贴壁细胞复苏过程如下：
44.将含有lmh贴壁细胞的冻存管于37℃恒温水浴锅中摇晃使之溶化，然后用75％酒精擦拭冻存管，置于超净工作台，用1ml移液枪将细胞悬液移入到装有10ml培养基的离心管中，800rpm/min离心5min，弃上清，重新加入10ml的培养基，混匀细胞后置于培养箱(37℃，5％co2)内培养。
45.其中，消化分散的具体步骤为：
46.弃去旧培养基，加入8ml无菌pbs清洗两次，然后加入1ml胰酶，轻轻摇晃，使所有细胞都沾染上胰酶，来回摇晃5～10次，弃去胰酶，用含10％胎牛血清的dme/f12(1:1)培养基终止消化，轻轻吹打均匀细胞。
47.(2)细胞悬液的制备
48.从液氮中迅速取出lmh全悬浮细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待lmh全悬浮细胞完全融化后，复苏细胞中加入约20倍体积的jsbio tm lmh sfm无血清培养基中，经800r/min离心5min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至125ml摇瓶中，并放置于装载轨道摇床(摇床速度为150r/min)的5％co2、37℃培养箱上进行悬浮培养，扩大培养至一定规模后，接种至生物反应器中培养，调节细胞初始密度为3～5
×
106个/ml，待培养至48～60h时，收获细胞悬液，此时细胞密度为8.0～12.0
×
106个/ml。
49.(3)i群禽腺病毒4型种毒的制备
50.将i群禽腺病毒4型接种于全悬浮lmh细胞液，放置于37℃、5％co2培养箱静置1h，加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，全悬浮lmh细胞液与细胞维持液的体积比为1:1～1:3，在30～37℃条件下，继续培养30～48h，待细胞活率降至85～90％，静置
沉降后弃去1/3～1/2的上清，并补加相同体积的细胞维持液，继续培养16～24h后收毒。将收集的病毒液重复上述接种收毒步骤，直至tcid
50
≥10
8.5
/0.1ml，将最后一次收获的悬浮毒作为种毒。
51.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
52.实施例
53.i群禽腺病毒4型的制备，步骤如下：
54.(1)第一次收毒
55.将全悬浮lmh细胞接种至激流式生物反应器中，利用jsbio tm lmh sfm无血清培养基进行培养，培养条件为：温度为37℃，ph为6.9～7.5，do控制在70～100％，转速40rpm/min。当lmh细胞数量达到4.0～6.0
×
106个/ml时，按moi值0.02接入i群禽腺病毒4型种毒，静置吸附1h，按lmh细胞液体积比1:1加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，在37℃条件下继续培养，ph为6.9～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min，当细胞活率下降到85～90％时，按lmh细胞液体积比1:1补加培养52h的细胞悬液(细胞密度约为9
×
106个/ml)至生物反应器袋中继续培养，培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。至病毒收获时，所需培养时间为64～72h。
56.(2)第二次收毒
57.在完成第一次收毒后，向生物反应器袋中加入培养52h的细胞悬液(细胞密度约为9
×
106个/ml)，按moi值0.008补加i群禽腺病毒4型种毒，静置吸附1h，按lmh细胞液体积比1:1加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，在37℃条件下继续培养，ph为6.9～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min，培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。至病毒收获时，所需培养时间为24～36h。
58.(3)第三次收毒
59.在完成第二次收毒后，向生物反应器袋中加入培养52h的细胞悬液(细胞密度约为9
×
106个/ml)，按moi值0.005补加i群禽腺病毒4型种毒，静置吸附1h，按lmh细胞液体积比1:1加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，在37℃条件下继续培养，ph为6.9～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min，培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。至病毒收获时，所需培养时间为24～36h。
60.(4)第四次收毒
61.在完成第三次收毒后，向生物反应器袋中加入培养52h的细胞悬液(细胞密度约为9
×
106个/ml)，按moi值0.02补加i群禽腺病毒4型种毒，静置吸附1h，按lmh细胞液体积比1:1加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，在37℃条件下继续培养，ph为6.9～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min，培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。至病毒收获时，所需培养时间为24～36h。
62.(5)第五次收毒
63.在完成第四次收毒后，向生物反应器袋中加入培养52h的细胞悬液(细胞密度约为9
×
106个/ml)，按moi值0.02补加i群禽腺病毒4型种毒，静置吸附1h，按lmh细胞液体积比1:1加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，在37℃条件下继续培养，ph为6.9
～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min，培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。至病毒收获时，所需培养时间为24～36h。
64.(6)第六次收毒
65.在完成第五次收毒后，向生物反应器袋中加入培养52h的细胞悬液(细胞密度约为9
×
106个/ml)，按moi值0.02补加i群禽腺病毒4型种毒，静置吸附1h，按lmh细胞液体积比1:1加入细胞维持液(细胞培养液jsbio tm cd eb66 488)，在37℃条件下继续培养，ph为6.9～7.5，do控制在50～80％，转速36rpm/min，培养至细胞密度为1.5～2.0
×
106个/ml、细胞活率为40～60％时收获病毒液。至病毒收获时，所需培养时间为24～36h。
66.上述i群禽腺病毒4型的制备，进行三次重复，各次收毒的病毒滴度，如表1所示：
67.表1
[0068][0069]
由表1可知，本发明能够实现i群禽腺病毒的连续收获，且前三次收获的病毒液中病毒滴度(tcid
50
)高达10
8.0
～10
9.5
/0.1ml，这使得本发明克服了现有技术中生物反应器无法连续多次收毒的缺陷。同时，由上述试验内容可知，在保证高病毒滴度的前提下，本发明在后续的繁毒过程中大大缩短了收毒时间。
[0070]
(一)不同培养时间的细胞悬液对病毒含量的影响
[0071]
选取培养时间分别为24h、36h、48h、60h、72h的细胞悬液，对i群禽腺病毒4型按照上述实施例所述的方法进行培养，在第三次收毒后终止病毒的培养过程。上述试验重复三次，分别记为第一组、第二组和第三组。
[0072]
试验结果如表2所示：
[0073]
表2
[0074]
[0075][0076]
由表2可知，在48～60h的培养时间内达到密度为8.0～12.0
×
106个/ml的细胞悬液，最有利于i群禽腺病毒4型的培养。超过60h的培养时间，代谢产物增多，营养物质耗尽，细胞容易进入衰亡期，不再适合病毒的接种和培养。
[0077]
(二)不同细胞密度的细胞悬液对病毒含量的影响
[0078]
选取细胞密度分别为4.0
×
106个/ml、8.0
×
106个/ml、12.0
×
106个/ml、16.0
×
106个/ml的细胞悬液(上述细胞悬液的培养时间均为52h，细胞起始密度分别为1.0～1.5
×
106个/ml、2.5～3.5
×
106个/ml、3.85-5.0
×
106个/ml和5.5～7.0
×
106个/ml)，对i群禽腺病毒4型按照上述实施例所述的方法进行培养，检测第二次收毒时病毒液中的病毒含量。上述试验重复三次，分别记为第一组、第二组和第三组。
[0079]
试验结果如表3所示：
[0080]
表3
[0081][0082]
由表3可知，由细胞密度在8.0～12.0
×
106个/ml之间的细胞悬液所培养的病毒，其病毒含量较其它情形更高。
[0083]
(三)疫苗应用
[0084]
1.疫苗的制备
[0085]
(1)灭活
[0086]
将上述实施例前三次制备的病毒液合并，加入甲醛溶液(体积百分浓度为10％)，使病毒液中甲醛终浓度为0.1％(体积百分浓度)，置于37℃恒温摇床中，摇振灭活20h(以瓶内的温度到达37℃开始计时)，灭活后的病毒液置2～8℃保存。
[0087]
(2)半成品检验
[0088]
无菌检验：取灭活的禽腺病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，检验结果为无细菌生长。
[0089]
灭活检验：将长成单层的lmh细胞培养液弃去，用pbs(0.01mol/l，ph值7.4)清洗3次，加入含2％胎牛血清的dme/f12培养液，将腺病毒灭活病毒液按体积0.1％的量接种于长成良好单层的lmh细胞中，置于培养箱(37℃、5％co2)中培养7d，将无cpe(细胞病变效应)病毒液按上述方法盲传2代，观察每代培养物cpe。检验结果显示，均无cpe出现，证明病毒液灭活完全。
[0090]
(3)灭活疫苗制备
[0091]
取注射用白油94份，加2％硬脂酸铝，加热，边加边搅拌，直至完全透明为止，再加入6份司本-80，混合后，高压灭菌，获得油相。取灭活的腺病毒病毒液加入高压灭菌的吐温80，使吐温80占总体积的4％，混匀，获得水相。将2份油相注入乳化罐内，慢速搅拌同时缓缓加入1份水相，加完后，中速混匀，然后3600r/min，乳化30min，获得疫苗。取疫苗10ml加入离心管中，3000r/min离心15min，应不出现分层。
[0092]
(4)分装
[0093]
定量分装，加盖密封，2～8℃保存。
[0094]
2.疫苗安全效果检测
[0095]
选取7日龄spf鸡10只。将每只鸡的颈部皮下分点注射疫苗1.0ml(颈后部两侧皮下各注射0.5ml)，观察14日，观察疫苗是否引起鸡的任何局部和全身不良反应。
[0096]
结果显示，经疫苗免疫的所有试验鸡，其精神、采食及饮水均未见异常，注射部位均无红肿反应。这说明，由本发明i群禽腺病毒制备的疫苗，安全可靠，对鸡禽无不良反应。
[0097]
3.疫苗免疫效果检测
[0098]
(1)血清学方法
[0099]
取7日龄spf鸡40只。将30只鸡作颈部皮下疫苗注射处理，注射剂量为0.3ml，并等分为三组(疫苗组1、2、3)，每组10只。将另外10只鸡作为对照组。接种后7日至5个月(分别为7日、14日、21日、28日、2个月、4个月、5个月)，每只鸡分别采血，分离血清，用琼扩试验检测免疫鸡和对照鸡的ⅰ群4型禽腺病毒抗体，记录抗体结果。
[0100]
试验结果如表1所示：
[0101]
表1
[0102][0103]
由表1可知，对照组鸡全部为阴性，三个疫苗组的鸡在21日以后琼扩抗体均呈现阳性，说明本发明制备的疫苗具有较好的免疫效果。
[0104]
(2)免疫攻毒法
[0105]
取7日龄spf鸡40只。将30只鸡作颈部皮下疫苗注射处理，注射剂量为0.3ml，并等分为三组(疫苗组1、2、3)，每组10只。将另外10只鸡作为对照组。免疫后21日，所有免疫鸡和对照鸡，肌肉注射ⅰ群4型禽腺病毒液(tcid
50
值约为2
×
10
5.0
/0.1ml)，从攻毒之日起开始观察鸡群情况，直至14天，并详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。
[0106]
试验结果如表2所示。
[0107]
表2
[0108]
组别数量/只注射途径免疫剂量(ml/只)效力检验结果判定结果疫苗组110颈部皮下0.3无发病案例合格疫苗组210颈部皮下0.3发病死亡1只合格疫苗组310颈部皮下0.3无发病案例合格对照组10颈部皮下-发病10只，死亡9只成立
[0109]
由表2可知，疫苗组免疫鸡在攻毒后14日，保护数均不少于9只；对照鸡全部发病，死亡9只，死亡鸡及发病鸡剖检病理变化：均出现典型的心包积水、肝脏肿大病变。
[0110]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。