诺奖得主 Jennifer 最新研究：CRISPR/Cas12c 无需切割

作者：杨超月

CRISPR/Cas 系统为细菌提供了适应性免疫，同时其准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力也为植物、动物和微生物基因组编辑提供了强大的工具。目前，基于 CRISPR-Cas9 基因编辑的多项临床实验也已启动并获得突破性结果，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径。

德国马克斯·普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna也因为开发了这一最重要的基因组编辑方法而摘得 2020 年诺贝尔化学奖的桂冠。

近年来，CRISPR/Cas 相关的研究也取得巨大的进展，其中多项研究均发现了一个包含 RuvC 的 Cas 蛋白家族，被称为Cas12，其变体表现出不同的生化和细胞活性。

其中，Cas12c最初发现于肠道宏基因组的小 DNA 片段中，虽然与其他 DNA 切割 Cas12 酶存在共同的特征，但这种蛋白质的一些生化特性仍然是未知的：比如其 RNA 识别和加工的机制尚不清楚；此外，由于缺乏可检测到的 DNA 酶活性，Cas12c 是否或如何为细菌提供抗病毒保护仍然是有待回答的问题。

2022 年 6 月 2 日，诺奖得主Jennifer A. Doudna及其团队在Molecular Cell发表了题为 A naturally DNase-free CRISPR-Cas12c enzyme silences gene expression 的研究文章，发现 Cas12c 是一种 RNA 引导的 DNA 结合酶，它不切割靶 DNA，而是通过 crRNA 介导的相互作用与靶 DNA 结合，并可以通过识别噬菌体必需基因来保护细菌免受噬菌体的感染。

图片来源：Molecular Cell

主要研究内容

Cas12c 可处理 pre-crRNA，但不切割 DNA

为了确认 Cas12c 是否具有发挥免疫保护功能的一系列酶活性，他们首先重组了 Cas12c 并对其进行了更详细的探索。结果发现，不像其他 Cas 酶可以直接结合重复序列的近端或内部，Cas12c 切割蛋白结合重复序列下游 17 个核苷酸的 pre-crRNA。

接下来，他们借助多种底物检测了 Cas12c 切割 DNA/RNA 的能力，均发现 Cas12c 无法切割这些与导向 RNA 互补的底物。因此，这些结果表明Cas12c 是 RNase（核糖核酸酶），而不是 DNase（脱氧核糖核酸酶），无法对 DNA 进行切割。

图片来源：Molecular Cell

Cas12c RuvC 结构域负责 pre-crRNA 的处理

随后，研究人员推测 Cas12c 的 RuvC 核酸酶结构域是执行 pre-crRNA 加工的部位。与该假说一致的是，当将 RuvC 金属配位羧酸盐突变后，Cas12c 的 pre-crRNA 处理活性随即丧失。

为了验证 RuvC 结构域在 pre-crRNA 加工中的作用，他们评估了 Cas12c 加工 pre-crRNA 后产生的 RNA 产物的性质，结果发现处理后的 RNA 切割片段的电泳迁移率降低，这与金属离子依赖的催化机制一致，表明Cas12c 的金属离子依赖的 RuvC 结构域负责 pre-crRNA 的处理。不过，后续的更加深入的实验结果也表明 RuvC 结构域在 Cas12c 中的作用也仅为 pre-crRNA 的处理。

图片来源：Molecular Cell

RNA 引导的 Cas12c 与 DNA 结合依赖于 pre-crRNA 的加工

上述的实验已经证明 Cas12c 不进行靶 DNA 切割，那么 Cas12c 是否能结合经由 RNA 引导的互补底物？结合筛选实验表明，Cas12c 在低纳米摩尔范围内可结合目标 dsDNA，并对部分碱基配对的 DNA 具有更强的亲和力。因此，这些数据表明，像其他 Cas12 酶和 Cas9 一样，Cas12c 也与目标 ssDNA 具有较高的结合亲和力但不能检测到与 ssRNA 结合。

图片来源：Molecular Cell

Cas12c 的 pre-crRNA 加工活性提示 crRNA 成熟可能对目标 dsDNA 结合至关重要。为了证实这一想法，他们测试了在 pre-crRNA 或成熟 crRNA 的介导下，Cas12c 的 DNA 结合亲和力。

结果发现，野生型 Cas12c 在每种情况下都能以相似的亲和力与目标 dsDNA 结合；然而，当 pre-crRNA 含有阻止 Cas12c 催化过程的硫代盐时，Cas12c 对 dsDNA 的结合作用有明显的减弱。因此，这些结果表明，CRISPR-Cas12c 系统的功能需要 pre-crRNA 的处理，如果没有 pre-crRNA 的处理，Cas12c 则无法有效地结合目标 dsDNA。