【Nature Plants】ECFG21！首次实现水稻受精卵转染基

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

2019年3月26日，Nature Plants杂志在线发表了来自的日本理化学研究所Takashi Okamoto课题组题为“An efficient DNA- and selectable-marker-free genome-editing system using zygotes in rice”研究论文。该研究首次实现将CRISPR-Cas9 RNP或载体直接递送到通过电融合分离水稻的配子产生的受精卵中，并具有约4-64％的高频率靶向突变，并实现编辑植物中无外源DNA和筛选标记。该研究方法同样适用玉米和小麦的受精卵，故该研究将是植物基因编辑的重要研究成果！

现代植物的遗传转化需要两个主要步骤：遗传物质的递送和再生，后者的必要性和困难性高度依赖于使用何种递送方法以及是否稳定转化期望。正如我们所知道，植物的遗传转化的主要阻碍是细胞膜外面的细胞壁。常规植物生物大分子投递方法中，农杆菌介导和基因枪是最成熟和最受欢迎的两种工具。但是这些方法需要植物的再生生成愈伤组织，这只能针对狭窄范围的植物物种。迄今为止，植物遗传转化缺乏一种能允许递送不同的生物分子进入所有植物组织和物种，而不需要借助外力并且不引起组织损伤。为此，寻找一种能避开/通过细胞壁的转化方法成为植物基因编辑的主要研究方向！而最近也相继报道了很多优秀的成果，如利用纳米管携带基因编辑蛋白后能顺利通过细胞壁进入细胞内，详细如下：

2019年2月25日，Nature nanotechnology(2017 IF :37.4 )杂志背靠背发表了两篇来自美国学者关于利用纳米材料的文章，它们分别是：

麻省理工学院Michael S. Strano课题组联合新加坡国立大学蔡南海实验室题为“Chloroplast-selective gene delivery and expression in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers ”的研究论文。该项研究报道了一种利用纳米材料，不依赖物种的方式进行叶绿体转化的新工具。该工具利用单壁碳纳米管选择性地将质粒DNA递送至叶绿体，而无需额外设备或化学试剂。

加州大学伯克利分校 Markita P. Landry课题组题为“High aspect ratio nanomaterials enable delivery of functional genetic material without DNA integration in mature plants”的研究论文。该论文同样报道了一种利用纳米管材料实现了以物种独立无转基因整合的有效DNA递送和强蛋白质表达的方法。（点击查看）

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该研究首先通过电融合分离的卵子和精子细胞制备水稻受精卵，并在配子融合后1小时用质粒进行PEG-Ca2 +介导的转染pGFP-ER质粒，证明了能进入细胞内并翻译成蛋白，并且检测其转染效率为71.4％，而且在融合后几天信号消失，说明只是瞬时表达。接下来，验证了组装Cas9蛋白和sgRNA组成的RNP，并通过PEG-Ca2 +介导的转染将其递送到水稻受精卵中，然后通过细胞团再生发育成植物，检测其突变效率（如下图）

在利用RNP或者DNA载体的组合中，如对外源转基因和内源基因的编辑都有较高效率。研究者将数据统计如下。研究发现突变率最高为64%，最低也有4%，但这个是双重突变，但是总体效率保持在14%以上。并且同时表明，RNP或DNA载体介导的基因组编辑可用于避免质粒中可能发生的外源DNA序列的整合。

因此，该研究通过将CRISPR-Cas9 RNP或载体直接递送到通过电融合分离的配子产生的受精卵中，其具有约4-64％的高频率靶向突变（见下图）。该研究是首次实现将CRISPR-Cas9组分直接递送到具有全能性的植物受精卵中来生产基因组编辑，而这些方法适用于玉米和小麦等作物，故该研究是植物基因编辑的重要研究成果！

iPlants评：

在这项研究中，通过电融合配子的水稻受精卵被用于递送CRISPR-Cas9组分，避开了细胞壁的阻碍，成功实现了无外源DNA和筛选标记的基因编辑，并能通过受精卵培养再生成植物，成功实现了稳定遗传传代。此外，已经报道了用细胞壁降解酶处理从授粉花中分离的玉米受精卵就能用PEG-Ca2 +介导转染。而且几种主要作物中也建立了受精卵分离的程序，并且可以将分离的玉米，小麦和大麦受精卵培养到再生植物中。故该研究可用于大部分作物之中，大大促进了这些重要谷物的改良及分子育种！故该文值得推荐！

当然，文献中提到了该实验中使用了ECFG21, Nepa Gene 机器来进行电融合。