关于多肽核酸（PNA）

作者：张馨予

由于寡核苷酸能识别互补的DNA或RNA序列，人们对将其作为治疗药物，分子生物学研究的工具及应用于诊断等抱有极大的兴趣。随着研究的深入，越来越多新的寡核苷酸类似物被研制出来，目的在于加强寡核苷酸的杂交能力，提高对核酸酶的抗性及膜通透性。如以巯基代替DNA骨架中的磷酸羟基，合成巯代磷酸、二巯基代磷酸、甲基化磷酸DNA等等。上述设计都仅对磷酸二酯键或糖基进行轻微修饰，主要是考虑到较大范围的修饰会降低或消除寡核苷酸杂交特性的缘故。但是原来寡核苷酸的缺点同样也仍然存在，如易被核酸酶降解，杂交后热稳定性差，可能有非特异性结合等。PNA则对传统方式进行了重大的变革，它是一类具有不带电荷的类似于肽链骨架结构并携带有碱基的核酸类似物。

PNA的设计及合成

PNA是由哥本哈根大学Riso实验室Nielsen等于1991年设计成功。考虑到是否可将整个糖-磷酸骨架置换，并且置换后的核酸类似物有与天然DNA相等的碱基间距、足够的柔性及刚性形态构造，同时还能与DNA或RNA进行碱基配对。他们利用一个简单的计算机DNA模型成功地设计并合成了PNA。PNA的合成首先是合成PNA单体，然后按标准的肽合成法进行PNA单体的寡聚化。

二、分子结构和化学特征

1. PNA分子结构如下图

2．化学特性

PNA以假肽主链代替核酸糖-磷酸主链，保留原有的四种碱基。肽的化学应用为PNA提供了几个优点：首先，通过对PNA的C-末端和N-末端用中性基团修饰，可得到中性的肽核酸，这样避免了多肽核酸与带负电的DNA、RNA之间的静电斥力；其次，PNA单体可由固相肽合成法聚集形成不同质量的寡聚体；需要研究的基团、嵌合子及金属离子可以连结到N-末端氨基或C-末端羧基上；另外，PNA分子为非手性分子，这样避免了其结构对映体的纯度问题。

PNA在形态和空间结构上与DNA十分相似。PNA寡聚体链一端有游离的氨基（-NH3），另一端有游离的羧基（-COOH），书写由左向右，左为氨基右为羧基，分别相应DNA的5ˊ端和3ˊ端。

三、生物学特性

1．生物稳定性 PNA的酰胺键不同于氨基酸的肽键，其生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。如T10PNA在人血清中、细菌抽提物中孵育两小时，都检测不到PNA发生降解。

2．杂交特性

PNA与DNA/RNA结合时有反向平行结合（antiparallel N端朝向核苷酸的3ˊ端结合）及正向平行结合（parallel N端朝向核苷酸的5ˊ端结合）。

（1）结合力强，且不受盐离子浓度的影响 PNA/DNA、PNA/RNA的结合较之DNA/DNA、DNA/RNA的结合更为稳定。这是因为DNA链和PNA链之间不存在静电排斥所至。一个15聚体的PNA和DNA双链的解链温度（Tm值）大约为70℃，而DNA/DNA双链的Tm值为55℃。在低离子浓度强度环境下，PNA可在DNA不能与其互补DNA杂交的温度条件下与DNA稳定杂交，特别是在无Mg2+环境中，能与DNA杂交，所以调整离子强度非常有助于PNA探针竞争与标本中的DNA或RNA杂交。如在0mmol/L离子强度下PNA/DNA的Tm值为72℃，而DNA/DNA的Tm值为38℃。

（2）特异性高与DNA/DNA结合一样，PNA与靶序列结合的特异性可通过调节寡聚物（oligomer）长度和杂交温度而达到，而且PNA/DNA或RNA杂交特异性较DNA/DNA或RNA杂交特异性更高，即前者的错配（mismatch）稳定性远较后者低。在混合的PNA/DNA15聚体中，一个碱基对错配可使Tm值降低8～20℃（平均15℃），而相应的DNA/DNA仅降低4～16℃（平均11℃），至于双碱基错配时PNA根本不与靶序列杂交。PNA的这种高水平的识别表明它具有分析点突变的能力。

（3）杂交速率快 PNA的杂交只需要较短时间（5-30min）就能与靶序列结合，而寡核苷酸引物则需几个小时。此外PNA作为杂交探针还有许多优点：在杂交条件的选择方面有较大的自由，标记选择很多，信号敏感性增加等。

DNA与PNA的特性比较

DNA

PNA

物理特性

带负电荷，修饰后较稳定仍可被核酸酶降解

中性，生物稳定性高，不易被核酸酶蛋白酶降解

结合位点

可非特异性结合

特异性极强

产生

化学合成（18-20nt）

化学合成简易（3-10mer）

导入方式

物理或化学方式

物理或免疫学方式

抑制水平

翻译

翻译、转录

临床应用

较多

应用较少