原代细胞的培养与建系(二)

作者：杨超月

③酶的浓度胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250），但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

④温度一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。

⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6~8.0之间，否则对细胞有损伤。

⑥无机盐离子若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。

⑦消化时间如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。

分离方法如下：

①过夜冷消化将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

②多次提取消化法多次提取消化法有以下三种：

热消化多次提取--将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。

冷消化多次提取--方法同上，只是消化温度为4℃。

先热消化后冷消化--将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。

（2）胶原酶（Collagenase）消化法

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。

鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。

表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别

项目 胰蛋白酶 胶原酶
消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织
用量 0.01%~0.5% 0.1~0.3mg/mL（200u/mL）
消化时间 0.5~2小时（小块） 1~12小时
pH 8~9 6.5~7.0
作用强度强烈缓和
细胞影响时间过长有影响无大影响
血清、钙、镁离子有影响无影响

表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间（小时）（0.5~1cm3）

酶种类 较硬组织 软组织
4℃ 室温 37℃ 4℃ 室温 37℃
胰蛋白酶（0.25%） 24~48 1~6 1~2 12~24 1~2 0.5~1
胶原酶（200u/mL） 24 6 6.5 12 3 0.25
两者联合（对冲） 12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2