李大力:基因编辑技术在细胞治疗中的研究进展

作者：杨超月

近年来,基因治疗领域捷报频传,在遗传疾病和肿瘤等疾病的治疗方面多个基因和细胞治疗药物获批上市, 更有一批新药将在2~3年内上市, 为患者带来革命性的治疗方案。相对于传统的外源基因导入的基因治疗策略而言, 基因编辑技术能实现基因组片段高效而精确的修复、插入和剔除，有望显著提高基因治疗的持久性和安全性。以锌指核酸酶(zinc fingernuclease, ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease, TALEN)、规律成簇的间隔短回文重复CRISPR/Cas核酸酶(clusteredregularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR- associated systems, CRISPR/Cas)为代表的基因编辑技术蓬勃发展为细胞治疗领域带来开创性突破。该文将重点回顾基因编辑技术应用于细胞治疗的不同策略, 探讨其在细胞治疗中的特点、应用前景、机遇和挑战,以期为基因编辑技术向细胞治疗的临床转化提供参考。

越来越多的研究发现, 绝大多数疾病的易感性都与DNA的变异相关, 其中最为典型的例子就是通常所说的遗传疾病, 特别是单基因遗传病。在已知的6，000多种遗传病中, 目前只有大约5%的疾病可以通过定期服用小分子药物或酶替代疗法进行治疗, 超过95%的病种没有有效的治疗方案, 治愈更是无从谈起[1]。上世纪60年代提出了基因治疗概念, 希望通过导入治疗性基因药物来治愈由于基因缺陷而造成的疾病, 为遗传疾病的治疗带来了希望, 特别是单基因突变造成的遗传病（https://www.ncbi.nlm.nih. gov/clinvar/）。经典的基因治疗主要有两种策略: 在体(in vivo)基因治疗和离体(ex vivo)细胞介导的基因治疗。前者是直接利用递送载体(主要分为重组病毒载体和非病毒递送载体)将基因药物进行局部注射或者静脉注射导入到靶器官进行表达而弥补缺陷基因的功能; 后者主要是将患者的细胞(一般是成体干/祖细胞、以CAR-T细胞疗法为代表的免疫细胞或者极具应用前景的iPS细胞)分离培养,同时进行基因操作以修复患者细胞的遗传缺陷, 再通过自体回输来进行治疗。

通过数十年的努力, 基因治疗在最近几年获得了突破性的进展。截止到2018年, 全球己经开展了2，600多项基因治疗的临床研究,共有7个基因治疗药物分别在中国、美国和荷兰等国家获批: 4个用于肿瘤治疗(2个溶瘤病毒: 英文名为Oncorine和 T-VEC; 2个CAR-T细胞疗法: Kymriah和Yescarta)、 3个用于遗传疾病治疗(治疗脂蛋白脂肪酶突变的Glybera, 治疗腺苷脱氨酶突变造成重症联合免疫缺陷的Strimvelis以及治疗REP65基因突变造成先天性黑矇症的Luxtuma)。Strimvelis、Kymriah和Yes- carta这3个药物都是通过离体细胞治疗的方式分别将基因药物整合到患者造血干细胞和T细胞再自体回输[2], 可见细胞介导的基因治疗策略非常成功。

细胞治疗相对于体内治疗显著的优势在于可离体编辑靶细胞群, 用可编程核酸酶修饰后可将校正后的细胞移植回原始宿主中。这种治疗模式可以利用多种基因药物的递送体系来对靶细胞进行基因操作, 例如电穿孔、阳离子脂质、细胞穿透肽和病毒载体[3]。这些导入方式与直接导入体内的在体疗法相比具有更高的效率, 同时体外基因操作的干细胞具有可培养和传代扩增优势,能进一步地富集所需的阳性细胞, 有效提高治疗效率。许多离体治疗可以控制所递送的治疗分子的特定剂量, 从而减少核酸酶的脱靶修饰[4]。离体细胞的纯化、培养和移植等专业技术的长足发展也为细胞治疗提供强有力的技术支持。目前来说,获批的几个基因治疗产品无一例外都是通过重组病毒作为递送载体, 不可避免地出现两个方面的担忧:一是非整合型病毒表达基因药物时效性不够长而整合型病毒会将外源基因随机插入到受体细胞的基因组中, 另一个是可能导致肿瘤的发生。最理想的策略是将基因药物精确整合到基因组的特定位点, 实现长时间稳定表达。由于肿瘤基因治疗的特殊性以及本期有专文讨论CAR-T 细胞疗法的进展,本文主要围绕基因编辑介导的离体细胞治疗的研究进展进行回顾和展望。

1 基因编辑进展概述

近年来, 随着多种人工核酸内切酶技术的出现, 高效的基因编辑技术得到了快速发展和广泛应用。人工核酸内切酶技术主要包括四种: 大范围核酸酶技术(meganuclease)、锌指核酸酶技术 (zincfinger nuclease,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcriptionactivator-like effector nuclease, TALEN) 和成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats, CRISPR)/ CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)系统。