显微注射法建立转基因小鼠模型的操作流程

作者：张馨予

本实验详细介绍了显微注射法建立转基因小鼠模型的操作流程。

实验原理

转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞)，然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，通过分析转基因和实验小鼠表型的关系，研究揭示外源基因的功能，而且可进行工程动物的大量生产。

主要试剂

1. M16溶液：

称取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4.7H2O， 0.0252 g CaCl2.2H2O，0.32 ml乳酸钠(60% 糖浆)，0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚红，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超纯水，0.22?m滤膜过滤除菌，分装后4℃储存不超过3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。

2. M2 溶液：

称取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4.7H2O,

0.0252 g CaCl2.2H2O,0.32 ml 乳酸钠(60% 糖浆), 0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖,0.0010g酚红 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超纯水，0.22um 滤膜过滤除菌，分装后4℃储存不超过3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES调节pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。

3. 工作液：无丙酮酸钠的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具体配制见说明书。

4. 注射缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 调节pH 为7.5。

主要设备

1．输精管切除术用器材：弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、自动小夹涂药器、自动小夹、带弯针4/0丝线及持针器、直径为10cm塑料 Petri氏培养皿（内盛70%乙醇）。

2．受精卵的采集用器材：70%乙醇、手术剪、10mL解剖剪、手术镊、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。

3．离体输卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科镊子、5号镊子、无菌30-mm组织培养皿、解剖显微镜、透明质酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。

4．DNA显微注射用器材

1）受精卵的收集与移动用器材：巴氏移液管、酒精灯、特制吸管、玻璃刀等。

2）凹玻片准备：一块标准的凹型载玻片（硅化）、矿物油（Sigma）、工作液等。

3）注射设备的设置：微型水力驱动设备、Hamilton Gas-Tite?注射器（250 ?l）、Intramedic?管道系统（外径1.27mm，内径0.86mm）、两只玻璃管道连接头、三通管连接器、一只带接头的60ml塑料注射器、一只器械套管、矿物油等。

4）受精卵的显微注射用器材：凹玻片（显微注射用）、倒置立体相差显微镜或倒置Nomarski立体光学显微镜、显微操纵器、千分尺（连接添满矿物油，且耐气构造的250ul汉密尔顿注射器）、气压装置(50ml充满气体的注射器) 、持卵管、预载DNA的注射针等。

5．输卵管转移的准备

1）手术试剂器材：麻醉剂（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副钝性齿镊、两副5号精细镊子、一副10cm手术剪、带自动小夹的金属大剪、一个小弹簧夹、外科缝线、解剖显微镜、纤维光学照明器、载针头的1ml注射器、kimwipe绵纸或外科纱布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手动移卵管等。所有的手术器械在使用前应该彻底清洗，70%乙醇消毒或高热灭菌处理。

实验材料

受体母鼠的准备：

输卵管转移的受体鼠应该为4-6周龄大小，体重在20-25克左右，严禁用低体重以及超重母鼠，若体重较低，其体能不足以维持妊娠，可能导致受精卵的重新吸收；若体重较重，麻醉剂被吸收入脂肪组织，降低麻醉效果，可能使手术困难，而且脂肪组织的存在意味着静脉的存在，所以手术时切掉脂肪组织可能导致不必要的出血，难以确认手术时的操作对象。出血也可能堵塞移卵管。选择输卵管转移前一天晚上与切除输精管小鼠交配的假孕母鼠，注射当天早上母鼠可见精栓。尽管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，随着体重的增加，它们将表现出不同程度的感觉消失，但它们是优良的哺育母鼠。另外，它们的价格也便宜。另一个成功的鼠系是B6D2F1，它们生命力强并有一定杂合优势。

麻醉剂：阿佛丁被证明是输卵管转移手术的有效麻醉剂。

实验步骤

1．鼠系克隆

1）动情期的探测：在转基因动物模型的建立中母鼠动情期的监测有很高的技巧性。小鼠的动情期主要划分为四个时期：

a. 动情后期：阴道口无扩张，周围组织为灰白色，阴道口周围无膨大

b. 间情期：阴道开口小，周围组织为灰色或蓝色。

c. 动情前期：阴道口逐渐扩张，阴道周围组织由粉红色变为红色。

d. 动情期：阴道周围组织颜色由红色转为粉红色，阴道口背侧唇可见条纹，阴道口腹侧唇可见肿大，阴道有分泌液外渗。