catenin信号通路抑制胃癌细胞的增殖和侵袭

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

胃癌(gastric cancer, GC)是常见的消化系统肿瘤，在我国发病率接近30%[-]。由于胃癌早期发病症状不太明显，确诊时已发展为晚期，细胞的侵袭和转移能力明显，预后差，5年生存率不足20%[-]。近年来，随着分子生物学的不断发展，虽然胃癌的发病率和病死率显著降低，但仍然是癌症死亡的第三大原因[]。手术结合药物化疗是目前临床上治疗胃癌的主要手段，但是复发率较高，药物治疗的并发症较多。双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是一种半合成的青蒿素衍生物，具有抗肿瘤的作用[-]。有研究发现，DHA能抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，诱导细胞凋亡[]。最新研究表明，DHA能够通过激活JNK1/2和p38 MAPK通路促进胃癌细胞的凋亡，提示DHA对胃癌具有一定的抗癌活性[]。本实验采用不同浓度的DHA作用于BGC-823和SGC-7901细胞，观察DHA对胃癌细胞BGC-823和SGC-7901增殖、侵袭、迁移和凋亡能力及Wnt/β-catenin通路的影响，进一步探讨DHA可能的作用机制，旨在为临床上DHA抗肿瘤治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料

人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞(中国科学院上海细胞生物研究所)，胎牛血清、新生小牛血清和胰蛋白酶(美国HyClone公司)，青霉素/链霉素(北京鼎国昌盛生物技术公司)，DMEM培养基和RPMI1640培养基(美国Gibco-BRL公司)，BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)，AV939、兔抗人Dvl2、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1抗体(美国Sigma公司)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，SKL2001(Millipore公司)，HRP标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(美国CST公司)，DHA(奥伦生物公司)。

1.2 细胞培养与分组

常规使用含10%胎牛血清和双抗(青霉素100 U/L，链霉素100 mg/L)的DMEM培养液(胃癌BGC-823细胞)和RPMI1640培养液(胃癌SGC-7901细胞)，在37 ℃，5%CO2的饱和湿度恒温培养箱中培养，隔天换液。用无血清的DMEM/RPMI1640培养基将DHA稀释成不同的浓度：10 μmol/L(低浓度)、20 μmol/L(中浓度)及40 μmol/L(高浓度)。将BGC-823和SGC-7901细胞分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白对照组，将对数生长期的细胞接种至6孔板，1×105/孔，当细胞汇合度达70%~80%，实验组加入3种浓度的DHA溶液，空白对照组加入等量无血清的DMEM/RPMI1640培养基，Wnt抑制剂组加入高浓度DHA和XAV939(1 μmol/L)，Wnt激动剂组加入高浓度DHA和SKL2001(20 μmol/L)，每组重复设置5个孔。

1.3 MTT法检测细胞增殖活力

取对数生长期的BGC-823和SGC-7901细胞，以5×103/孔接种到96孔板中，细胞贴壁后，加入不同浓度的DHA(10、20、40 μmol/L)分别孵育24、48、72 h后，移去含DHA的培养基，加入10 μL/孔MTT(5 mg/mL)于37 ℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，用酶标仪测定各孔在570 nm波长的光密度值[D(570)]，每个样本设置3个复孔。

1.4 划痕实验检测细胞迁移

将对数生长期的胃癌细胞以2×105/孔接种到提前在底部画好刻度的6孔板，当细胞汇合度达到95%时，移去培养基，用已消毒的10 μL枪头垂直划一条泳道，用PBS洗涤2次后，在显微镜下拍照，记录0 h细胞泳道的距离。然后加入不同浓度的含无血清培养基DHA，培养48 h后，在显微镜下观察细胞迁移情况，拍照，每组细胞随机选取5处划痕位置测量宽度。细胞相对迁移能力＝(0 h划痕距离－48 h划痕距离)/0 h划痕距离×40%。

1.5 Transwell实验检测细胞侵袭

用Matrigel包被Transwell小室基底膜上室面，室温过夜。取在对数生长期的胃癌细胞，经胰酶消化后，1×105/孔于24孔板Transwell中，Transwell小室的上室加入200 μL含不同DHA浓度的无血清培养基，在Transwell下室加入600 μL 15%胎牛血清的DEMR/RPMI1640培养基。常规培养48 h后，4%多聚甲醛固定10 min，用PBS清洗2次，甲醇透化5 min，加入1%结晶紫染色液染色5 min，PBS洗涤2遍，在显微镜下观察细胞并计数。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期的胃癌细胞，以3×105/孔接种于6孔板，用不同浓度的DHA作用于胃癌细胞48 h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后制备成细胞悬液，加入预冷的70%乙醇，4 ℃固定过夜。加入PBS洗涤2次后弃上清，加入PI工作液，室温下避光孵育30 min后，流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

不同浓度的DHA孵育胃癌细胞(3×105/孔)48 h后，用预冷的PBS洗涤2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液(0.25 mg/mL)，轻轻混匀，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.8 RT-PCR检测Wnt/β-catenin相关蛋白的表达