catenin信号通路影响胃癌BGC823细胞的凋亡

作者：杨超月

Yes相关蛋白（Yes-associated protein, YAP）参与调控细胞的生长、器官的发育，与肿瘤的发生有关[]。研究显示，YAP在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中表达异常，并且其表达水平的高低与肿瘤患者分期及预后等有关[-]。在胃癌中发现YAP过度表达，并且与胃癌患者的病理特征等有关[]。YAP敲低可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，如胰腺癌、乳腺癌等，对于肿瘤细胞的凋亡也具有调控作用[-]。Wnt/β-catenin在真核生物体细胞内广泛存在，在正常的成熟细胞中激活水平极低，而在肿瘤细胞中过度激活，与肿瘤细胞的增殖、凋亡等有关[]。研究表明，YAP可以通过作用于Wnt/β-catenin信号通路影响细胞的生长，提示两者之间存在潜在联系[]。本实验以BGC823细胞为体外研究对象，通过小RNA干扰技术降低细胞中YAP的表达，明确YAP对胃癌BGC823细胞凋亡的影响及对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。

1 材料与方法 1.1 材料

BGC823细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Caspase-3）活性测定试剂盒和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9, Caspase-9）活性测定试剂盒为武汉艾美捷公司产品；Lipofectamine2000为美国Invitrogen公司产品；MMLV反转录试剂盒为美国Promega公司产品；qRT-PCR为大连宝生物公司产品；β-连环蛋白（β-catenin）抗体、c-myc抗体、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗体、辣根过氧化物标记的二抗均为美国Abcam公司产品；YAP、β-actin引物由上海生工公司合成；YAP siRNA1、YAP siRNA2、siRNA control为美国Santa Cruz Biotech公司产品。YAP siRNA1：5’-GCAUCUUCGACAGUCUUCUTT-3’，5’-AGAAGACUGUCGAAGAUGCTT-3’。YAP siRNA2：5’-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3’，5’-UUUGGUUGAUAGUAUCACCTT-3’。

1.2 细胞分组

BGC823细胞中转染YAP siRNA1和YAP siRNA2，同时转染siRNA control，依次命名为si-YAP1、si-YAP2和si-NC，以不作任何处理的BGC823细胞记为Control。细胞转染用Lipofectamine2000，具体步骤参照转染试剂说明书。BGC823细胞培养参数为：饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱。细胞为90%时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代细胞。细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI1640中。

1.3 qRT-PCR测定转染后细胞YAP mRNA水平

Control、si-NC、si-YAP1、si-YAP2细胞培养48 h以后，提取总RNA。用MMLV反转录试剂盒进行反转录，程序为42℃ 65 min；70℃ 5 min；合成的cDNA保存于-80℃。以cDNA为模板，用qRT-PCR扩增。引物序列如下：β-actin F5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’，β-actin R5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。YAP F5’-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3’，YAP R5’-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3’。结果以2-ΔΔCt法计算。

1.4 蛋白质印迹法测定转染后细胞YAP蛋白水平

Control、si-NC、si-YAP1、si-YAP2细胞培养48 h以后，提取细胞中的总蛋白，蛋白保存在-80℃。取蛋白样品，用BCA法对蛋白进行定量。以每个泳道添加40 μg蛋白进行电泳，电泳前将蛋白样品和上样缓冲液以等体积混合煮沸5 min。在浓缩胶中以90 V的低压进行电泳，在分离胶中以120 V的电压电泳，观察染料进入到分离胶的底部之后关闭电源。把蛋白凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，以100 mA电流进行转膜，转膜在4℃进行。转膜结束后把膜放在用TBST稀释的牛血清白蛋白中封闭2 h。取出膜，放入含有YAP一抗（1:200稀释）的平皿中，4℃反应过夜后，再把膜放入含有HRP标记的二抗（1:3 000稀释）中，室温孵育2 h。取出膜，用ECL显色试剂盒显色，凝胶成像仪拍照，分析灰度值，以β-actin为内参。

1.5 MTT法测定细胞增殖

Control、si-NC、si-YAP1细胞种植到96孔板中，分别培养24、48、72、96 h以后，用MTT法测定各组胃癌细胞增殖情况。步骤如下：在每孔中添加20 μl的MTT，把细胞放在37℃培养箱内继续培养约4 h，取出培养板，在每个孔中依次添加150 μl的DMSO溶液，置于振荡仪上10 min，放在酶标仪上测定每孔492 nm的A值。每个组设置5个重复孔，测定前以空白孔调零，空白孔中不加细胞。

1.6 平板克隆检测细胞克隆形成能力

Control、si-NC、si-YAP1细胞以每个培养皿200个细胞接种到细胞培养皿中，每个培养皿中含有10 ml的培养液。放在37℃、5%CO2培养箱中孵育14 d后，肉眼可以观察到形成的细胞克隆。把培养液吸弃后，用PBS洗涤2次，加入4%的多聚甲醛固定各组细胞15 min。用吉姆萨染色液染约20 min后，用水把染液冲洗掉，放在空气中干燥。计数细胞克隆数目，用（细胞克隆数目÷细胞总数）×100%表示细胞克隆形成率。

1.7 流式细胞术测定细胞凋亡