探寻circRNA漂浮不定的电泳迁移速率背后的原因

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

探寻circRNA漂浮不定的电泳迁移速率背后的原因

2022-05-30 08:42 来源:本地红姐晓天下

原标题：探寻circRNA漂浮不定的电泳迁移速率背后的原因

circRNA是一种共价闭环的单链RNA，通过反向剪接天然产生，广泛存在于真核细胞中。circRNA不具有游离末端，稳定性优于线性mRNA，有极大的优势成为下一代RNA技术平台。今年上半年，国内外的研发人员已经成功开发出多款环形RNA新冠疫苗泰国玛希隆大学开发嵌合Spike环状新冠mRNA疫苗，受到领域内众多的关注。

目前，广泛使用的体外合成circRNA的方法主要依靠酶连成环或者变更的具有催化活性的内含子序列。但是，circRNA技术在应用过程中始终存在一个非常棘手的问题：如何精确辨别circRNA和线性RNA？用来对circRNA进行质量分析的手段包括，凝胶电泳，RNase H/R切割，靶核苷酸导向的RNase H切割，HPLC以及single-hit hydrosis。

我们在前面介绍过circRNA免疫原性一直存在着争议争议|外源circRNA是否会触发机体免疫反应？。 2017年，斯坦福医学院 Howard Y Chang最早报道使用体外合成的circRNA会触发强烈的天然免疫反应。2019年，Howard Y Chang又发现体外合成circRNA时，使用N6-甲基腺嘌呤修饰核苷酸会抑制circRNA免疫原性。同年， Daneil.G.Adernson通过一系列纯化手段得到的体外合成circRNA不会触发机体产生天然免疫反应。2021年，中科院生化细胞所 陈玲玲报道通过具有自我剪接活性的内含子产生的circRNA具有免疫原性，但是，通过T4连接酶产生的circRNA不具有免疫原性。

为探究关于circRNA免疫性不同结论背后的原因， 2020年5月5号， Howard Y Chang 和 Daneil.G.Adernson联合在 Molecular Cell上发布文章：Circular RNA migration in agarose gel electrophoresis，他们发现circRNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率会受到凝胶类型，电泳时间，上样buffer组成，电压的影响，呈现出与实际Size不相符合的表观Size，使得circRNA和线性RNA之间的分析鉴定受到极大的干扰。他们提醒circRNA领域内的研究同行，应该联合其他的分析手段确认circRNA的电泳结果，以免得出错误的研究结论。

标准琼脂糖凝胶电泳分离circRNA

RNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率取决于RNA质量和形状。RNA质量和长度相关，相同结构的RNA，长序列要比短序列迁移得慢。RNA的形状，即二级结构，也会影响迁移速率，因此经常使用变性剂来解开二级结构。

circRNA在体外环化合成反应结束后，产物中会存在多种类型的RNA杂质，主要包含precursor RNA(circRNA合成的线性模板RNA)，Niked RNA（circRNA产生切口，变为长度相同的单链线性RNA,），剪切掉的上下游内含子序列。

研发人员用标准琼脂糖凝胶电泳来分离RNase R切割前后的环化反应产物，并且设计一系列靶向不同区域的探针，用Northern杂交去验证分离结果。在标准琼脂糖凝胶电泳图中，Precursor RNA 条带靠近2000bp，并且会被RNase R降解掉。circRNA条带在1000-1500bp之间，可以抵抗RNase R降解。但是，分子量大小相同的circRNA与Nicked RNA重叠在一起无法区分开来，随着降解时间加长，Nicked RNA逐渐被降解掉，只剩下circRNA，因此1000-1500bp之间的条带随着RNase R降解时间延长而逐渐变淡。

在Northern杂交验证中，1-UpExc/5-DownExc探针会检测到precursor RNA和剪切掉的内含子序列。2-UpRet/3-GLuc/4-DownRet探针可以检测到3种RNA，precusorRNA/Nicked RNA/circRNA，其中precusorRNA/Nicked RNA为线性RNA，会随着时间延长逐渐被RNase R降解掉，条带逐渐变带直到检测不到。6-Ana 只能检测到circRNA条带，可以看到随着RNase R降解，circRNA会产生非常多的Nicked RNA而导致条带逐渐变淡。

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标准琼脂糖凝胶电泳和Northern杂分析环化反应产物。 E-Gel EX 琼脂糖凝胶系统电泳circRNAE-Gel EX 系统