非放射性地高辛标记DNA探针法

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

掌握非放射性地高辛标记DNA探针法。

实验原理

以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法（Saiki等，1985）。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP）。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。或用X-film放射自显影。地高辛标记DNA的基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。其中关键步骤是要得到高灵敏度、高特异性的探针。
标记：采用随机引物标记方法，可标记少至10ng，多至3ug的DNA。能在新合成的DNA链每20-25个核苷酸，掺入一个Dig-dUTP，反应时间约为1h。
杂交：按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃，重复使用。
免疫学检测：封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记DNA结合，出现杂交的半抗原-标记DNA，显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和硝基兰四唑NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续3天。典型的例子是在24小时后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。
应用：地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg的同源DNA，能检测1µg哺乳动物DAN中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成），而且消除了放射性的不安全问题。试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交）以替代同位素标记和放射自显影术。

主要试剂

1. DNA稀释缓冲液有两管，每管1ml：

[成分为：Tris-HCl(10mM)，EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50µg/ml）。

2. 六聚核苷酸混合物

3. 标记用混合底物：此管内有50µl，浓度的dNTP标记用混合底物，含dATP（1mL）dCTP(1mM)，dGTP(1mM)，dTTP(0.65mM)和Dig-
dUTP(0.35mM)，pH6.5(20℃)。

4. DNA聚合酶Ⅰ大片段（标记级）：此管内有25µl，DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2 U/µl　。

5. （Dig）AP结合物：此管内有200µl，多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750 U/ml。

6. NBT有两管，每管1.25ml，溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液（75mg/ml）。

7. X-磷酸盐，两管，每管0.9ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液（50mg/ml）。

8. 封阻试剂，两瓶，每瓶有50g粉剂。

需配制的溶液：

EDTA(0.2M),pH8.0(20℃)
LiCl(4M)
70%(V/V)乙醇
Tris-HCl(10mM)
EDTA(1mM)，pH8.0(20℃)
10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐
10%(V/V)SDS
0.3M柠檬酸三钠
3M NaCl
20×SSC
pH7.0,Tris-HCl(100mM)
NaCl(150mM)
pH7.5Tris–HCl(100mM)
MgCl2(50mM)pH9.5(20℃)
NaCl(100mM)

实验步骤

1. 取10µl待测DNA，于1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。

2. 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号, 拍照, 记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。

3. 杂交用胶的制备
   (1) 将凝胶浸没入30mL 0.25M HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。
   (2) 用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
   (3) 将凝胶浸没入30mL　0.4M NaOH中30min, 使它被中和。

4. 准备DNA从凝胶向膜转移的平台
   (1) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。
   (2) 另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。
   (3) 准备10 X SSC 转移液。
   (4) 将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。

5. 安装毛细管转移装置
   (1) 将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。
(2) 将8 0mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。
   (3) 将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。
   (4) 用保鲜纸封住凝胶四边。
   (5) 将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。
   (6) 将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。
   (7) 转移几小时或过夜(至少4小时)
注意：勿使转移液干枯。