寡核苷酸分离纯化方法与流程

作者：杨超月

1.本发明涉及寡核苷酸分离纯化方法，更具体地涉及使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化寡核苷酸的方法。

背景技术：

2.目前市面上使用较为广泛的寡核苷酸纯化方法主要有：聚丙烯酰胺凝胶(page)纯化法、寡核苷酸纯化柱(rpc/opc)柱纯化法、高效液相色谱(hplc)纯化法、毛细管凝胶电泳(cge)纯化法等等，而page纯化法在纯化效果和经济成本上具备的综合优势，使其成为寡核苷酸纯化中最受欢迎的一种纯化方式。
3.目前通用的寡核苷酸page纯化方法是16％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化方法结合乙醇沉淀回收方法，但该page方法存在两大缺陷，极大地限制了其在寡核苷酸纯化回收上的效率和质量。
4.其一，16％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的原理主要是根据寡核苷酸片段在聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同来实现大小片段的分离，但该纯化工艺的缺陷在于：目前所使用的16％尿素变性page胶对于与目的产物相差1到2个核苷酸(1-2nt)的合成失败寡核苷酸残缺片段(与目的产物相差1个核苷酸的产物n-1、与目的产物相差2个核苷酸的产物n-2)的分离效果并不理想，导致page电泳回收之后的产物内还残留一些相差1-2nt的不合格寡核苷酸，严重影响到该产物在后续工艺上的使用。
5.其二，在page胶电泳之后，需要经过泡胶回收将寡核苷酸产物从凝胶中提取出来，其中比较常用的回收方法有磁珠回收法，乙醇沉淀回收法，试剂盒回收法
[1-6]
。磁珠回收法和试剂盒回收法主要局限于高昂的实验成本，无法适用于大规模商业生产中。所以目前使用较为广泛的是实验成本较低，所需工艺设备较少的乙醇沉淀回收方法，但是该回收方法的缺点在于实验流程的步骤繁琐，耗费时间人力较多，产物损耗较多。
[0006]
因此，非常有必要开发一种对寡核苷酸分离纯化效果更佳，工艺更为简洁高效，回收率更高的寡核苷酸page纯化回收方法，应用到实验生产中。

技术实现要素：

[0007]
本发明人发现，利用25％的非变性page胶进行寡核苷酸的电泳纯化，可有效分离6-200nt，特别是6-50nt范围内的寡核苷酸，相较现有技术中使用的16％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶，其对寡核苷酸的电泳条带分辨率更高，可成功分离相差1-2nt(1-2个核苷酸)的寡核苷酸，具备更高的纯化分离效果。其次，在泡胶回收阶段，可采用直接回收法：使用预热泡胶缓冲液泡胶30min即可滤除胶块，取回收液定量使用。相较于16％尿素变性page胶电泳纯化方法，可节省工艺时间4h，并且寡核苷酸产物回收率由12％提高至25％。
[0008]
本发明工艺采用f-page(快速聚丙烯酰胺凝胶纯化法，fast-page)的纯化方法，可实现对6-200nt的寡核苷酸的快速电泳纯化，可成功分离相差1nt的目标寡核苷酸和杂质，纯化后的目标物纯度可达90％以上，可满足分子生物、基因测序等实验需求。
[0009]
本发明的一方面提供寡核苷酸分离方法，所述方法包括使待分离的寡核苷酸样品进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，由此分离所述寡核苷酸，其中所述凝胶中聚丙烯酰胺的浓度为20-28％。
[0010]
在一些实施方案中，所述凝胶中聚丙烯酰胺的浓度为25％。
[0011]
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度为6-200nt。
[0012]
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度为6-50nt。
[0013]
在一些实施方案中，所述待分离的寡核苷酸样品中至少含有长度相差为1-10nt的两种寡核苷酸，优选为至少含有长度相差为1-2nt的两种寡核苷酸。在另一些实施方案中，所述待分离的寡核苷酸样品中至少含有长度相差为1-5nt的两种寡核苷酸。在一些实施方案中，所述待分离的寡核苷酸样品包含长度相差为1个、2个、3个、4个或5个核苷酸的两种或两种以上的寡核苷酸。
[0014]
本发明的另一方面提供寡核苷酸纯化方法，所述方法包括：
[0015]
(1)使用上述寡核苷酸分离方法分离寡核苷酸样品；
[0016]
(2)回收分离的目的寡核苷酸。
[0017]
在一些实施方案中，所述步骤(2)包括割取步骤(1)分离的目的寡核苷酸条带，用泡胶液浸泡所述寡核苷酸条带后直接回收所述寡核苷酸，所述泡胶液是水或水溶液。
[0018]
在一些实施方案中，用泡胶液浸泡的时间为0.2-1.5h，优选为0.5-1h，更优选为0.5h。
[0019]
在一些实施方案中，所述泡胶液经预热后使用；优选地，预热温度为40℃-80℃，更优选为60℃。
[0020]
在一些实施方案中，所述泡胶液为含有1-10mm tris-hcl和1mm edta，ph 7.5-8.5的水溶液，优选为含有10mm tris-hcl和1mm edta，ph 8.0的水溶液。
[0021]
本发明的又一方面提供了一种分离寡核苷酸的非变性聚丙烯酰胺凝胶，其特征在于，所述凝胶中聚丙烯酰胺浓度为20％-28％，优选地聚丙烯酰胺浓度为25％。
[0022]
在一些实施方案中，配置所述凝胶的原料包括丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺。
[0023]
在一些实施方案中，所述丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的重量比为29:1-19:1，优选为29：1。
[0024]
在一些实施方案中，配置所述凝胶的原料进一步包括三羟甲基氨基甲烷-硼酸缓冲液(tbe缓冲液)、过硫酸铵和四甲基乙二胺。
[0025]
在一些实施方案中，其中所述过硫酸铵的质量体积浓度为0.02％-0.07％(w/v)，优选为0.05％。在一个实施方案中，所述过硫酸铵的质量体积浓度为0.05％。在本发明中，使用的过硫酸铵为10％的过硫酸铵，调整至所述过硫酸铵质量体积浓度为0.02％-0.07％，优选为0.05％浓度。
[0026]
在一些实施方案中，其中所述四甲基乙二胺的体积浓度为0.09％-0.125％(v/v)，优选为0.1％。在一个实施方案中，所述四甲基乙二胺的体积浓度为0.1％。
[0027]
在一些实施方案中，其中所述三羟甲基氨基甲烷-硼酸缓冲液为10
×
tbe，加入的体积浓度为5％-30％，优选为10％。在一个实施方案中，所述三羟甲基氨基甲烷-硼酸缓冲液为10
×
tbe，加入的体积浓度为10％。
[0028]
本发明又一方面提供了寡核苷酸纯化方法，所述方法包括：
[0029]
(1)使用上述的凝胶分离寡核苷酸样品，
[0030]
(2)回收分离的目的寡核苷酸。
[0031]
在一些实施方案中，所述步骤(1)中待分离的寡核苷酸样品中至少含有长度相差为1-10nt的两种寡核苷酸，优选为至少含有长度相差为1-2nt的两种寡核苷酸。在另一些实施方案中，所述步骤(1)中待分离的寡核苷酸样品中至少含有长度相差为1-5nt的两种寡核苷酸，优选为至少含有长度相差为1-2nt的两种寡核苷酸。
[0032]
在一些实施方案中，所述步骤(2)包括割取步骤(1)分离的目的寡核苷酸条带，用泡胶液浸泡所述寡核苷酸条带后直接回收所述目的寡核苷酸，所述泡胶液是水或水溶液。
[0033]
在一些实施方案中，其中所述泡胶液为含有1-10mm tris-hcl和1mm edta，ph 7.5-8.5的水溶液，优选为含有10mm tris-hcl和1mm edta，ph 8.0的水溶液。在一个实施方案中，其中所述泡胶液为含有10mm tris-hcl和1mm edta，ph 8.0的水溶液。
[0034]
在一些实施方案中，其中用泡胶液浸泡寡核苷酸条带的时间为0.2h-1.5h，优选为0.5h。在一个实施方案中，其中用泡胶液浸泡寡核苷酸条带的时间为0.5h。
[0035]
在一些实施方案中，所述泡胶液经预热后使用；优选地，预热温度为40℃-80℃，更优选为60℃。在一个实施方案中，所述泡胶液经预热后使用，所述预热温度为60℃。
[0036]
本发明的另一方面提供了一种泡胶液，所述泡胶液用于直接回收聚丙烯酰胺凝胶中分离的目的寡核苷酸，其特征在于，所述泡胶液为含有1-10mm tris-hcl和1mm edta，ph 7.5-8.5的水溶液，优选为含有10mm tris-hcl和1mm edta，ph 8.0的水溶液。在一些实施方案中，所述泡胶液中tris-hcl的含量可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm，edta含量可以是0.5mm、0.6mm、0.8mm、0.9mm或1mm。在一个实施方案中，所述泡胶液为含有10mm tris-hcl和1mm edta，ph 8.0的水溶液。
[0037]
在一些实施方案中，所述泡胶液经预热后使用；优选地，预热温度为40℃-80℃，更优选为60℃。在另一个实施方案中，所述泡胶液经预热使用，预热温度为60℃。
附图说明
[0038]
通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中：
[0039]
图1.(a)f+h(23nt+22nt)混合样品的16％变性胶电泳图；(b)f+h(23nt+22nt)混合样品的18％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(c)f+h(23nt+22nt)混合样品的20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(d)f+h(23nt+22nt)混合样品的25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(e)f+h(23nt+22nt)混合样品的28％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0040]
图2.(a)第一次实验a、b、c(18+20+22nt)混合样品的16％变性胶电泳图；(b)第一次实验a、b、c(18+20+22nt)混合样品的25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(c)第二次实验a、d、e(18+20+22nt)混合样品的的16％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(d)第二次实验a、d、e(18+20+22nt)混合样品的25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0041]
图3.(a)第三次实验f与g(23nt+24nt)混合样品的16％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(b)第三次实验f与g(23nt+24nt)混合样品的25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(c)第四次实验f与h(n＝23nt,n-1＝22nt)混合样品的16％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；(d)第四次实验f与h(n＝23nt,n-1＝22nt)混合样品的25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0042]
图4.(a)16％变性聚丙烯酰胺凝胶纯化回收样品a、b、c、d、e的中控检测图；(b)
25％非变性聚丙烯酰胺凝胶纯化回收样品a、b、c、d、e的中控检测图；(c)25％非变性聚丙烯酰胺凝胶纯化回收样品f、g、h的中控检测图。
具体实施方式
[0043]
除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
[0044]
术语“聚丙烯酰胺凝胶”通常是指在聚合催化剂的存在下，由丙烯酰胺单体和交联剂聚合而成的凝胶。“交联剂”是指在丙烯酰胺单体聚合过程中与丙烯酰胺单体反应从而形成交联的分子。典型的交联剂包括ν，ν'-亚甲基-双丙烯酰胺，亦称“甲叉双丙烯酰胺”。其它交联剂包括二丙烯酸乙二醇酯(ed)、二烯丙基酒石酸二酰胺(datd)和二羟基亚乙基双丙烯酰胺(dheba)。聚合催化剂是本领域技术人员熟知的，包括例如选自过硫酸铵、n，n'-四甲基乙二胺(temed)、核黄素和p-二甲基氨基丙腈中的一种或两种或更多种，聚合催化剂均以本领域技术人员所知的量使用。制备聚丙烯酰胺凝胶中的原料通常还包括缓冲液，例如tris-硼酸缓冲液、tris-乙酸缓冲液等。聚丙烯酰胺凝胶电泳的制备方法是本领域技术人员熟知的。
[0045]
本发明中，当提及聚丙烯酰胺凝胶时，百分比的数字是指总丙烯酰胺(即总的单体，包括交联剂)的浓度，通常按重量体积百分比计。本发明中，总丙烯酰胺的浓度可以选自20％-28％，例如可以是21％-27％、22％-26％、23％-25％或24-25％，比如约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％或约28％，还包括任意以前述任意两个点值为端值之间的浓度范围，最优选为25％。总丙烯酰胺中丙烯酰胺单体与甲叉双丙烯酰胺交联剂的比例范围可以是按重量计35：1-15：1，也可以是按重量计29:1-19:1。例如可以是32:1-18:1、31:1-19:1、30：1-19：1、29:1-25:1、29:1-23:1、29:1-21:1、29:1-20:1、28:1-25:1、28:1-23:1、28:1-21:1、28:1-19:1、27:1-25:1、27:1-23:1、27:1-21:1、27:1-19:1、26:1-23:1、26:1-21:1或26:1-19:1，还包括以前述任意两个点值为端值之间的比例范围，优选为29：1和19：1。
[0046]
术语“变性聚丙烯酰胺凝胶”和“非变性聚丙烯酰胺凝胶”是本领域技术人员熟知的，前者是指所述聚丙烯酰胺凝胶中含有变性剂，后者是指在所述聚丙烯酰胺凝胶中不含有变性剂。变性剂包括例如尿素、去离子甲酰胺、sds等。如本领域技术人员所知，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳均可用于分离核酸序列，其中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳无需在凝胶中加入变性剂，操作起来比较简单，但是一般情况下检测分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法均是本领域技术人员熟知的。非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制例如可以是将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺以及其他配制原料混合均匀，加入电泳模具内，待凝胶凝固成型，即得。还可以先将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和水混合，配制为聚丙烯酰胺母液，使用时将聚丙烯酰胺母液与其他配制原料混合均匀，加入电泳模具内，待凝胶凝固成型，即得。
[0047]
本发明中，术语“寡核苷酸”典型地是单链的。术语“寡核苷酸”是指由2个或更多个核苷酸通过共价键形成的聚合物。所述核苷酸可以是核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna)。在一些实施方案中，寡核苷酸具有例如6-200个核苷酸，例如6-150个核苷酸，例如6-100个核苷酸，例如6-50个核苷酸，例如10-30个核苷酸，例如18-24个核苷酸，例如20-24个
核苷酸，例如22-24个核苷酸，例如23-24个核苷酸。寡核苷酸所含有的核苷酸数在本发明中也可以通过碱基数(nt)表示
[0048]
本发明所述的“寡核苷酸样品”是指寡核苷酸混合物，其中含有两种或更多种不同长度的需要分离的寡核苷酸。不同长度的寡核苷酸之间在长度上可以相差1-2nt、1-3nt、1-4nt、1-5nt、1-6nt、1-7nt、1-8nt、1-9nt或1-10nt。所述寡核苷酸样品可以来自于核酸提取产物、pcr产物、核酸合成产物或其他来源。寡核苷酸样品中除了含有不同长度的寡核苷酸之外，不排除还可以含有其他成分，例如在提取或合成过程中产生的杂质。其中目的寡核苷酸是指需要从寡核苷酸样品中分离出的一种或多种寡核苷酸，该目的寡核苷酸可通过凝胶电泳分离出的感兴趣的目的条带得到目的寡核苷酸。
[0049]
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
[0050]
1材料与方法
[0051]
1.1材料
[0052]
1.1.1聚丙烯酰胺凝胶的制备
[0053]
16％变性聚丙烯酰胺凝胶的配置方法参考《分子克隆实验指南
·
第三版》
[0054]
16％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶200ml的配料如下：
[0055]
试剂量丙烯酰胺30.4g尿素84g甲叉双丙烯酰胺1.6g10
×
tbe20ml去离子水180ml10％过硫酸铵1mltemed(四甲基乙二胺)200μl
[0056]
25％非变性聚丙烯酰胺凝胶200ml的配料如下：
[0057]
试剂体积ml40％丙烯酰胺母液125去离子水5510
×
tbe2010％过硫酸铵1temed(四甲基乙二胺)0.2
[0058]
18％非变性聚丙烯酰胺凝胶
[0059]
试剂体积ml40％丙烯酰胺母液90去离子水9010
×
tbe20
10％过硫酸铵1temed(四甲基乙二胺)0.2
[0060]
20％非变性聚丙烯酰胺凝胶
[0061][0062][0063]
28％非变性聚丙烯酰胺凝胶
[0064]
试剂体积ml40％丙烯酰胺母液140去离子水4010
×
tbe2010％过硫酸铵1temed(四甲基乙二胺)0.2
[0065]
10
×
tbe(三羟甲基氨基甲烷-硼酸)缓冲液配置
[0066]
试剂量tris(三羟甲基氨基甲烷))108g硼酸55gedta(乙二胺四乙酸二钠)7.5g去离子水1l
[0067]
40％聚丙烯酰胺母液配置
[0068]
试剂量丙烯酰胺77.3g甲叉双丙烯酰胺2.7g去离子水200ml
[0069]
玻璃板的清洗、硅化处理、安装、灌胶等操作参照《分子克隆实验指南
·
第三版》
[0070]
1.1.2关键设备
[0071]
[0072][0073]
1.1.3样品准备
[0074][0075]
本实验中，使用固相亚磷酰胺法以200nmol载体规模合成相差1-2nt的寡核苷酸粗产品作为实验样品，分别以200μl饱和尿素溶解待用。
[0076]
第一、二次实验随机选择三条相差2nt的寡核苷酸粗产物(第一次实验的寡核苷酸样品a，b和c；第二次实验的寡核苷酸样品a，d和e)，等量(60-160μl体积)混匀后作为实验样品；
[0077]
第三次实验选择相差1nt的寡核苷酸(寡核苷酸f和g)等量(60-160μl体积)混匀作为实验样品；
[0078]
第四次实验特别选用序列仅相差1nt的两条寡核苷酸(寡核苷酸样品f和h)等量(60-160μl体积)混匀作为实验样品，模拟实际实验生产中的目的寡核苷酸(n)与合成失败片段(n-1)的分离提纯。
[0079]
1.1.4 page胶的选用
[0080]
分别以18％，20％，25％，28％的自配非变性page胶对n&n-1的混合样品进行电泳分离，效果如图1所示。其中图1.b所示，18％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳相差1nt的混合样品f+h(23nt+22nt)时，明显出现无法完全(部分分离)分离的现象，而20％-28％的非变性胶均可有效分离混合样品，回收之后的样品经质谱检测，均为合格样品。后续实验将采用分离效果较好的25％非变性聚丙烯酰胺凝胶与16％的变性聚丙烯酰胺凝胶做对比实验。
[0081]
1.2方法
[0082]
1.2.1 page电泳
[0083]
按照1.1配制page胶加入玻璃板内，待玻璃板内凝胶凝固成型后，将玻璃板安装在dyy-8c电泳仪上，在电泳槽内加入足量的新制1
×
tbe，在第一个泳道点上marker，冲洗其余
泳道后上样，上样之前将1.1中制备的样品通过水浴60℃变性10min。上样后以恒定电压电流电泳，直至maker到达玻璃板2/3处，电泳参数设置为：电压400-600v，电流40-50ma。此处使用16％的变性聚丙烯酰胺凝胶和25％的非变性聚丙烯酰胺凝胶作对比实验，其余电泳参数条件均保持一致。
[0084]
1.2.2拍照
[0085]
电泳完毕后，使用tanon凝胶成像系统或紫外灯照射成像，本实验采用紫外分析仪进行紫外照射成像，对比观察两种page胶的电泳情况。
[0086]
1.2.3凝胶中回收寡核苷酸产物
[0087]
1.2.3.1割胶
[0088]
电泳完毕后，将凝胶从玻璃板中取出，平铺在保鲜膜上，放置在zf-1型三用紫外分析仪上，在紫外灯的照射显影下，用洁净的手术刀从凝胶上割取寡核苷酸条带，转移至事先准备好的5ml注射器内(此注射器经过特殊处理，带有沙芯、堵头以及在注射器管壁上的排气孔)。
[0089]
1.2.3.2泡胶回收
[0090]
本实验针对16％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳寡核苷酸片段采用常用的乙醇沉淀方法进行回收；针对25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳寡核苷酸片段采用直接回收法；以下是两种回收方法的具体介绍。
[0091][0092]
(1)乙醇沉淀法：具体操作过程参照《分子克隆实验指南
·
第三版》
[0093]
(2)直接回收法：将注射器中的碎胶通过沙芯滤除，2ml离心管收集含有寡核苷酸产物的泡胶缓冲液。其中，泡胶缓冲液的配制：
[0094]
1)1m tris-hcl(ph 8.0)50ml的配制：称取tris碱6.06g，加超纯水40ml溶解，滴加浓hcl约2.1ml调ph至8.0，定容至50ml。
[0095]
2)0.5m edta((乙二胺四乙酸)(ph 8.0)50ml的配制：称取edta-na2·
2h2o9.306g，加超纯水35ml，剧烈搅拌，用约1g naoh颗粒调ph至8.0，定容至50ml。(edta二钠盐需加入naoh将ph调至接近8.0时，才会溶解。)
[0096]
3)1
×
泡胶缓冲液(10mm tris-hcl，ph 8.0；1mm edta，ph 8.0)的配制：
[0097]
1m tris-hcl bufferph＝8.0(5ml)
[0098]
0.5m edtaph＝8.0(1ml)
[0099]
向烧杯中加入约400ml dd h2o均匀混合，将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；
室温保存。
[0100]1×
泡胶缓冲液可以包含的组分1-10mm tris-hcl，ph 8.0和1mm edta，ph 8.0配置而成，除上述1
×
泡胶缓冲液外，去离子水等主要成分含水的试剂都可以作为泡胶液，但本发明中配制的泡胶缓冲液为核酸最佳保存试剂。
[0101]
1.2.4检测
[0102]
1.2.4.1定量检测
[0103]
通过tecan infinite m201pro酶标仪对回收后的寡核苷酸产物(1.2.3.2泡胶回收的产物)进行定量检测，计算其回收样品量。
[0104]
1.2.4.2质谱检测
[0105]
使用lcms液质联用质谱仪对纯化回收的寡核苷酸产物进行分子量检测，根据其检测结果判定是否含有非目的寡核苷酸片段的杂质，借此验证不同page胶对杂质条带的分离效果。
[0106]
1.2.4.3分析板检测
[0107]
通过10％变性page胶对纯化回收后的寡核苷酸样品进行分析板条带检测，根据其条带成像，判断寡核苷酸产物中是否存在杂质。
[0108]
1.2.4.4 hplc检测
[0109]
通过对纯化后的寡核苷酸产物进行hplc纯度的检测，判定其纯度是否达标(本实验中以hplc纯度》90％为达标)。
[0110]
2结果与分析
[0111]
2.1分离效果的对比
[0112]
在电泳操作中，除电泳所用page胶有所不同，其余条件参数均保持一致。从图2可以看出针对相差2nt的混样寡核苷酸，16％的变性聚丙烯酰胺凝胶与25％非变性聚丙烯酰胺凝胶均可实现有效分离，但25％的非变性聚丙烯酰胺凝胶的分离效果相较更佳。
[0113]
并且更为重要的是从第三次的实验结果来看，25％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在针对相差1nt的混合寡核苷酸样品的分离上效果明显优于16％的变性聚丙烯酰胺凝胶，如图3所示。因此，在模拟实际实验生产中目标寡核苷酸产物(n)与合成杂质(n-1)的第四次纯化实验中，25％非变性page胶对相差1nt的两条寡核苷酸的分离效果达到预期，能够满足实际生产中对合成杂质的分离纯化。
[0114]
从图4可见，对回收后的寡核苷酸产物进行10％变性page胶分析板检测，结果显示回收后的样品条带均明亮清晰，无杂带，表明纯化回收后的样品均质量合格。进一步验证了25％非变性聚丙烯酰胺凝胶可以实现相差1-2nt寡核苷酸片段的有效分离。
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2.2回收率
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经过对回收后的寡核苷酸产物进行定量分析，计算得出各自的回收量。从下表1可见，使用f-page纯化回收法(25％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及直接回收法)得到的寡核苷酸产物回收率在25％左右。而使用常规的16％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及乙醇沉淀回收法得到的寡核苷酸产物回收率在12％左右，在回收效率上新工艺f-page要明显优于现行page工艺。
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表1.各实验寡核苷酸的回收率、质谱及hplc检测结果
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2.3质谱及hplc检测
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从表1可见，f-page纯化回收的实验寡核苷酸的质谱检测结果符合标准，纯度与常用的page纯化方法(16％变性聚丙烯酰胺凝胶纯化，乙醇沉淀回收)纯化回收的寡核苷酸一致，均达到90％以上。
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结论
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通过实验对比，新开发的工艺f-page(25％非变性page胶+直接回收法)相较常用的page(16％尿素变性page胶+乙醇沉淀法)纯化方法，如表2所示，在寡核苷酸纯化及回收上有着明显的优势，其分离杂带的效果更强，回收的操作更为简洁高效，样品的回收率也更高，是一种高效经济的寡核苷酸纯化回收方式，能够在实验室以及大规模寡核苷酸纯化生产中得到应用。
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表2不同page电泳分离纯化效果的比较
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工艺名称原工艺16％尿素变性胶新工艺f-page工艺流程电泳+割胶+泡胶+乙醇沉淀电泳+割胶+泡胶回收工艺时间9h5h分离效果无法有效分离1-2nt有效分离1-2nt样品纯度(纯化后)》90％》90％样品回收率12％25％
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本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。