咋回事儿呢？搞了一个东西进细胞，结果mRNA上调

作者：杨超月

作者揭示，在肝癌细胞转移的一个重要步骤—上皮-间质转化（EMT）过程中，m6A修饰的mRNA在癌细胞中增加。m6A的Writer基因METTL3的抑制下调了肝癌细胞中m6A的修饰丰度。作者还发现，Snail是EMT的关键转录因子，Snail CDS区中的m6A而不是3’UTR区的m6A触发了肝癌细胞中Snail mRNA的多核糖体介导的翻译。这项研究突出了m6A在调节肝癌细胞EMT中的关键作用。

结果解析（重点已经给大家加粗高亮显示了哦）

咋回事儿呢？搞了一个东西进细胞，结果mRNA上调

Fig1. 癌细胞的EMT（上皮-间充质转化）受mRNA的m6A水平调节

作者使用TGF-β诱导Hela/HepG2细胞发生EMT（补充图片里面证明了TGF-β诱导后发生EMT进程），之后使用LC-MS/MS的方法对其进行m6A的检测，发现TGF-β诱导组的m6A水平显著高于对照组（a），由此说明癌细胞EMT的发生伴随mRNA的m6A水平增高。甲基化转移酶（writers）在m6A的发生中是必不可缺的，作者之后对Hela细胞的METTL3（writers的一种）进行敲除（Mettl3Mut/− HeLa）。

Mettl3Mut/− HeLa的迁移能力以及侵袭能力显著低于Mettl3Mut HeLa（b-划痕实验，c-Transwell侵袭实验）。Mettl3Mut/− HeLa组的MMP2和FN（间充质细胞的标记物）的mRNA和蛋白水平显著低于Mettl3WT HeLa，而E-cad（与侵袭转移能力呈负相关）的mRNA和蛋白水平显著高于Mettl3WT HeLa（d，e，g），说明METTL3的敲除可抑制癌细胞的EMT进程。

为了验证m6A水平在EMT中的作用，作者进行了ALKBH5（关键的m6A去甲基酶）过表达，发现ALKBH5过表达处理与METTL3敲除处理结果一致（MMP2、FN下调，E-cad上调）（f）。TCGA数据库分析结果显示肝癌组织中的METTL3显著高于正常组织（h），且肝癌组织中 CDH1（E-cad的基因名）的表达与METTL3的表达呈负相关关系（i）。

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Fig2. 在经历EMT的细胞中m6A调节的基因的变化

确认m6A在EMT中存在调控功能，那具体是哪个基因起到中间作用了呢？作者对EMT 前后细胞进行m6A-seq。在对照和EMT细胞中，GGAC基序都高度富集在m6A位点内（a）。起始和终止密码子附近的m6A峰特别丰富，且主要集中在外显子区域（b，c）。作者将对照与EMT细胞进行比较，鉴定出128个发生了1.5倍的m6A变化的基因。GO分析表明少数基因与经历EMT的癌细胞中粘附连接和肌动蛋白细胞骨架的形成有关（d）。 综上，m6A修饰发生在少数与EMT期间的细胞连接，粘附和迁移有关的基因上。

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Fig3. 在癌细胞中，Snail参与m6A调控EMT进程

为了找到涉及癌细胞的m6A调控EMT的潜在靶点，作者鉴定了84个具有关键功能的EMT相关基因与61个m6A调控基因（大于2.0倍m6A变化）之间进行Overlap分析，发现4个基因在EMT前后 m6A 和表达水平发生了显著变化（a，b）。其中Snail是一个已知调控EMT 的转录因子，因此作者接下来将研究的重点放在 Snail 上。作者进行m6A RIP- qPCR，EMT组的SNAI1 mRNA的m6A水平显著高于对照组（2.3倍）（c）。与control组相比，METTL3敲除组以及ALKBH5过表达组的Snail表达水平显著降低（d）。由此确认Snail同时受到METTL3（m6A甲基转移酶）和ALKBH5（m6A甲基位点识别蛋白）的调控，即Snail的表达水平受m6A 的修饰水平调控。随后，作者对Snail在EMT中的功能进行了验证，显示Snail 可以促进 EMT 的发生，且Snail 过表达可回补METTL3缺失引起的EMT进程减缓（e，f）。

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Fig4. 在癌细胞中，m6A触发Snail mRNA的翻译

前面已经证明Snail受m6A修饰调控，那调控具体发生在什么水平呢？qPCR验证发现 METTL3敲除之后，pre-mRNA和mature mRNA的表达水平显著升高（这一点结果与图3d的蛋白表达水平结果相反），且两者的稳定性也显著升高（a，c，d）；但是Mettl3Mut /-细胞中Snail蛋白水平下调，Snail蛋白的稳定性在野生型和Mettl3Mut /-HeLa细胞之间无显著差异（e），这表明m6A使得Snail mRNA稳定性降低而不影响其蛋白稳定性。在CHX（蛋白质翻译抑制剂）而非MG-132（蛋白酶体活性抑制剂）的存在下，Mettl3Mut /-HeLa细胞中TGF-β诱导的Snail表达减弱（f）。之后作者构建了pmirGLO-Snail荧光素酶报告载体，结果显示Snail在Mettl3Mut /-HeLa细胞中的翻译效率明显低于HeLa WT细胞中的翻译效率（g）。综上表明m6A诱导的Snail表达与翻译调控有关。