基于单细胞测序描绘肝癌免疫图谱

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　癌症免疫疗法是近年新兴的治疗方法，也成为癌症治疗领域中的最热门的趋势，被认为是能够彻底治愈恶性肿瘤的希望所在，例如免疫检查点抑制剂疗法，靶向作用一系列名为免疫检查点的蛋白，如CTLA-4抗体及PD-1抗体等目前都取得了良好的疗效。但是在不同病人或者不同癌症之间的效果却很不均一，以及癌症的治疗缺乏理想抗原靶标等，因此，基于单细胞测序系统详尽的研究肿瘤微环境免疫图谱，有助于癌症免疫疗法的发展及有效靶点的发现。

　　那么什么是癌症免疫疗法呢？

　　癌症免疫疗法就是通过刺激人体内通常攻击病原体的免疫系统，使其特异性进攻癌细胞。简单来说，免疫疗法主要是帮助免疫细胞识别癌细胞，或者帮助免疫细胞消灭癌细胞。免疫细胞如同我们身体里的“警察”，正常情况下，免疫细胞能够识别并消灭机体里存在的“坏人”，但是当癌症发生时却存在“免疫逃逸”现象，也就是说免疫细胞的监管作用存在失灵，由于癌细胞通过伪装，外表装扮成好人，导致免疫细胞无法识别和消灭癌细胞。或者有些时候，免疫细胞明明识别出了癌细胞是坏人，却没有任何反应，变成了“围观的吃瓜警察”，这是因为癌细胞给免疫细胞发送抑制信号，从而抑制免疫细胞的活性。

　　去年6月，北大张泽民教授及其团队在生物学领域顶级期刊《Cell》上发表了题目为“Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing”研究论文，该研究通过大规模单细胞测序技术对肝癌相关T淋巴细胞进行分析，首次在单细胞水平上描绘肝癌微环境中免疫图谱，发现了肝癌免疫疗法的潜在靶点，也为我们从多角度系统性理解肝癌T淋巴细胞特征奠定了基础。于是，本期生命树之谜，小编将这篇精彩的文献分享给大家，共同学习！

　　课题的idea决定了文章的水平，实验前对课题系统完善的设计是成功的一半。研究者收集了6例肝癌患者的外周血，癌旁正常组织、肝癌组织作为实验样本，首先对获得肝癌样本进行了大量的外显子和RNA-seq测序，根据肝癌患者DNA上的突变以确定收集到的样本确实是肝癌样本，另外运用免疫荧光证实肝癌组织中有侵润性T淋巴细胞及其亚群的存在，值得注意的是，发现在肿瘤核心CD8 T细胞数量比在外皮质层要低得多，说明在肿瘤组织中存在CD8 T细胞侵润的不足，进一步为了研究肝癌相关T淋巴细胞特性，从所获得的各个组织中流式分选出CD3+CD8+ Tc（cytotoxic T cells）细胞，以及CD4+CD25- Th（Helper T cells）细胞和CD4+CD25+ Tregs（regulatory T cells）细胞进行单细胞转录组测序 (图1)

图1. 肝癌侵润性T细胞的定位与分离

　　1肝癌相关T淋巴细胞聚类及亚型分析

　　为了揭示肝癌相关T淋巴细胞内在特性及其潜在的功能亚型，单细胞转录组测序后，对获得的5063单个细胞的RNA-seq数据进行无监管的降维聚类，总共聚类为11个稳定的T细胞亚群，包括 5个CD8 T细胞亚群和6个CD4 T细胞亚群，每个亚群都有其独特表达的标记基因。其中C1_CD8-LEF_1，主要是外周血来源的Tc细胞,特异的表达初始T细胞标记基因，如LEF1和CCR7。C2_CD8-CX3CR1，高表达CX3CR1，FCGR3A和FGFBP2等与T细胞效应功能相关的基因。C3_CD8-SLC4A10, 是一群特异性表达SLC4A10、ZBTB16和RORC分子的MAIT（Mucosal-Associated Invariant T cells）细胞。C4_CD8-LAYN，主要是肿瘤组织来源的耗竭性CD8 T细胞，表达较高水平的耗竭性标记基因，CTLA4、PDCD1和HAVCR2等。C5_CD8-GZMK，与C4存在一些共同表达的基因，如PDCD1和DUSP4，但是特异表达GZMK基因。而且在不同患者中CD8 T细胞各个亚群总体分布模式具有可比性。特异表达CCR7的C1_CD8-LEF_1 T细胞亚群和C2_CD8-CX3CR1细胞亚群在外周血中普遍存在，MAIT细胞在肿瘤相邻的肝组织中普遍存在，而在肿瘤组织中却大量存在耗竭性CD8 T细胞。

　　同样的，CD4 T细胞聚类为6个T细胞亚群。C6_CD4-CCR 7亚群来源于外周血CD4 T细胞，特异表达SELL和CCR7等初始T细胞标记基因，C7_CD4-FOXP3主要是外周血分离来源的Tregs细胞，C8_CD4-CTLA4是一群在肿瘤组织中高度富集的Tregs细胞。C9_CD8-GZMK，主要是来源正常组织和肿瘤组织中的Th细胞，其特征是高表达GZMA和CCL5基因。C10_CD4-CXCL13是特异性表达CXCL13、PDCD1、CTLA4基因的一群耗竭性CD4 T细胞。C11_CD4-GNLY是一群具有细胞毒性的CD4 T细胞(图2)。