常用PCR技术

作者：张馨予

热启动PCR，是提高PCR特异性和可信度的最好的方法之一。通过阻止温度升高到变性温度前的PCR反应的发生而阻止引物与基因组DNA上潜在的高同源性区域结合引起的错误引发（mispriming）。同时热启动还使引物通过互补区域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。

热启动PCR可通过三种方式实现：

1)手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg离子或dNTP），当反应液升温到80℃以上或变性温度时再加入。手动热启动操作繁琐，而且因为增加了一次开盖操作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的加样误差，可能使平行样品间扩增结果产生差异；更简单的手动热启动是在冰上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也最低

2)将聚合酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融化石蜡后，酶才进入反应液中；

3)使用热启动DNA聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热启动DNA聚合酶相比手动热启动操作简便，缺点是用热启动DNA聚合酶的价格较高。

Touchdown PCR：

降落PCR，是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对PCR循环条件进行耗时的优化实验。降落PCR过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火温度下完成，整个程序的退火温度可降低10-15℃。

在最初几个循环内，高温使引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度最大的模板序列（很可能这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火事件，因此保证靶序列得到优先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管最终的退火温度降低到足以使非特异性产物有效扩增的温度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此抑制非特异性产物的进一步形成。

Nested PCR：

巢式PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加DNA扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式PCR在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。

Multiplex-PCR：

多重PCR，指在一个PCR管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重PCR检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增6个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重PCR基础上发展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重连接探针扩增技术)使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重PCR耗时的优化步骤。

Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）：

长距离PCR，普通的Taq聚合酶一般只能扩增不超过3-5kb的片段，通过使用特定的聚合酶和缓冲液成分，来扩增较长的DNA链（10-40kb以上）。长距离PCR时经常会在10-15个循环后，使每个循环的延伸时间都比上一循环的时间增加10秒左右，以补偿聚合酶活性的损失。

Clony PCR：

菌落PCR，通过PCR手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过PCR预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为PCR反应的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区，因此尽管插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。

RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：

逆转录PCR，是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使RNA（mRNA）的技术。反应由两个阶段组成：

1. 使用逆转录酶，通过逆转录反应“RT”合成与RNA互补的cDNA（complementary DNA）

2. 使用PCR扩增特异性的cDNA。

由于PCR的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。

RT-PCR可广泛用于表达图谱分析（用来确定基因的表达）；鉴定RNA转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显子和内含子的位置；检测病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。

RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）：