恒温扩增技术技术发展与市场规模

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

前言：核酸检测技术近年来发展迅猛，尤其是在分子诊断POCT领域。目前市场上主要的POCT核酸检测技术为qPCR核酸检测技术，特异性强，灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，并很好的实现高通量检测，但热循环过程需要热循环仪。热循环仪体积大、价格较高，时间也相对较长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。恒温扩增核酸检测技术由于其检测快速、价格低廉等优势，而在及时现场检测市场中脱颖而出。

2019年末将近时，面对突如其来的新型冠状病毒肺炎，核酸检测被广泛提及。作为IVD领域主要的的检测方式之一，核酸检测利用核酸扩增技术、核酸测序技术、基因编辑技术和分子杂交技术，能够快速对患者生物样本中的核酸进行检测，为感染病例确诊提供医学检验证据。

病原体检测是目前临床上核酸检测应用最广的领域，主要包括乙型肝炎、丙型肝炎、寨卡病毒、艾滋病、人乳头瘤病毒等。除病原体检测外，核酸检测还被用于肿瘤基因检测、遗传病检测、产前筛查等多个领域。

核酸检测技术经过几十年的发展，已经形成了较为完善的技术体系。2019年全球核酸检测市场规模达到85亿美元，中国为106亿人民币，中国占全球市场规模的18%，每年以超过15%的速度实现增长，2025年有望达260亿元，成为全球最具潜力的市场。

核酸检测的使用者包括医院检验科、第三方医学检验中心、体检机构、疾病防疫中心、血站，根据《卫生计生委关于促进单采血浆站健康发展的意见》，2019年底实现单采血浆站核酸检测全覆盖。而目前全国共设置血液中心32个，中心血站321个，中心血库99个，按照年检测量每8-10万人份配置1套核酸检测系统，这将为核酸检测仪器创造广阔的市场空间。

近年来，在核酸检测细分领域中，分子诊断POCT产品正在不断增多，其中两大技术流派的产品备受关注：一个流派是采用qPCR技术进行检测的分子诊断POCT产品，目前市场总额为36亿美元，2024年市场总额预计达到54亿美元（如图1所示）。目前很多公司都已开发出了成熟的产品，使qPCR技术取代传统PCR成为核酸检测的主流。以这次新冠病毒的检测为例，中国迄今为止批准了19个紧急授权使用的试剂检测产品，其中核酸检测试剂11个，抗体检测试剂8个。而核酸检测中的9种是qPCR技术；另一个流派是采用恒温扩增技术进行检测的分子诊断POCT产品，市面上这类产品并不是非常多，但恒温扩增技术的优势正逐渐取代qPCR技术，已经在临床医学、检验医学、分子生物学、水和食品安全等不同领域中的发挥着重要作用，特别是在致病菌、病毒等传染微生物的检测中。2019年恒温核酸扩增技术的市场总额为19亿美元，2024年其市场总额预计达到33亿美元（如图1所示），有望实现11.1%复合增长率。

qPCR与恒温核酸扩增技术的市场及增长率比较

图1. qPCR与恒温核酸扩增技术的市场及增长率比较 (源自药时代)

qPCR特异性强，灵敏度高，可以定量对病原体进行检测，并很好的实现高通量检测，但热循环过程需要热循环仪。热循环仪体积大、价格较高，时间也相对较长，使其在基层的推广和现场检测受到了极大的限制。20世纪90年代初，研究人员尝试创新开发无须热变性的恒温核酸扩增技术。恒温扩增技术的基本原理和反应成分各不相同，但本质上要解决的核心难题是使新合成的DNA模板在恒定的温度下退火变性进而引发进一步的扩增反应，这使得恒温扩增技术具备检测快速、价格低廉等优势 (如表1所示) ，而在及时现场检测（point of care）市场中脱颖而出。

不同核酸分子诊断技术的优劣势比较

表1. 不同核酸分子诊断技术的优劣势比较

恒温扩增技术可以分成两类，第一类是扩增反应依赖于特异性引物延伸；第二类是扩增反应依赖于限制性内切酶。

第一类包括：①1991年由Compton等提出的依赖核酸序列扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA），主要依赖AMV逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶和一对引物来完成等温扩增；②Fire等于1995年首次提出借鉴微生物环状DNA复制过程的滚环扩增技术（Rolling circle amplification，RCA）。在RCA反应中，phi29 DNA聚合酶是至关重要的组成部分，具有持续DNA合成能力和链置换活性；③Notomi等于2000年开发环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。LAMP使用4条引物，特异性强、灵敏度高、检测下限可达几个拷贝；④Wharam等于2001年创建了依赖RNA转录信号介导的RNA扩增技术（Signal-mediated amplification of RNA technology，SMART）。SMART不是通过增加靶序列拷贝数实现检测，而是通过信号的放大来进行；⑤Vincent等于2004年提出的模拟动物体内DNA复制机制的依赖解旋酶扩增技术（Helicase-dependent amplification，HDA）；⑥Kurn等于2005年首次报道单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA）。该技术主要通过使用一条嵌合引物 "5′-RNA-DNA-3′"、RNase H和具有强链置换活性的DNA聚合酶来实现核酸等温扩增；⑦Piepenburg等参照了T4噬菌体DNA复制系统于2006年创建了一种新型的等温扩增技术，使用酶来打开双链DNA，该技术称为重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）；⑧随后发明的重组酶介导等温核酸扩增技术（Recombinase Aided Amplification，RAA）技术原理与RPA相似，不同之处在于RAA的重组酶来源于细菌或真菌，而RPA的重组酶来自T4噬菌体；⑨实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）是我国上海仁度巴西vs瑞士让球有限公司于2008年将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术；⑩交叉引物扩增技术（Crossing Priming Amplification，CPA）是我国杭州优思达生物公司于2008年自主研发的一种等温扩增技术，可利用3对引物（两条交叉引物、两条剥离引物和两条探针）、Bst DNA 聚合酶等得到大量重复带有交叉位点的扩增产物。