RNA蛋白互作技术新突破气象监测系统！Cell报道纯化RNA交联蛋白
5. 亚砷酸盐介导的翻译阻滞对总蛋白和RNA相互作用蛋白组的影响
6. XRNAX与CLIP-Seq结合鉴定RNA结合蛋白
结果：
1. XRNAX从紫外交联细胞中提取蛋白交联RNA
目前通用的RNA提取法为Trizol法，作者采用紫外交联的MCF7细胞，收集TRIZOL法中间相，去除游离蛋白质和RNA，以及DNA酶消化以消除DNA，产生了含高浓度RNA(>1000ng/mL)和蛋白质(>0.7mg/mL)的提取物。（Fig1A）然后作者比较了传统TRIZOL法和XRNA法，发现经RNase和Protein K消化后，XRNAX琼脂糖凝胶有条带消失，提示存在RNA蛋白复合物。（Fig1B）接下来，作者对两种方法提取的RNA类型进行了分析。（Fig1C）发现XRNAX法提取物含大量编码蛋白及lincRNA。（Fig1D）质谱及GO富集分析结果证实XRNAX提取物含有大量RNA蛋白复合物。（Fig1E）为了排除非RNA与蛋白结合的干扰，作者用同位素标记处理细胞（SILAC），结果显示，未经交联的蛋白也被XRNAX提取出来了。（Fig1F）为了解决这个问题，作者在SILAC下游设计了二氧化硅纯化柱，这一做法有效的使RNA交联蛋白的提取率从65%提高到了89%。
2. RNA相互作用位点与结构域的鉴定
作者采用已建立的XRNAX方法鉴定RNA与蛋白相互作用的位点。胰酶消化XRNAX提取物分析其蛋白成分，（Fig2A左）MSFragger分析结果显示经尿苷酸修饰后质谱出现明显位移。（Fig2B）对环U交联肽氨基酸分析结果显示，与MCF7总裂解产物的肽相比，该法含大量苯丙氨酸（F）、赖氨酸（K）和甘氨酸（G），（Fig2E）并且大部分的交联肽定位于RNA识别域。（Fig2C）接下来，作者在MCF7细胞中瞬时表达FLAG-HA标记的C7orf50及DUF2373，在多核苷酸激酶(PNK)试验中证实了它们在体内结合RNA的能力。（Fig2D）
3. 三种细胞系整合的人RNA结合蛋白质组
为了探索完整的RNA结合蛋白组，作者将此富集方案（XRNAX，消化，然后二氧化硅富集）应用于三个常用的人源细胞系，MCF7，HeLa和HEK293。（Fig2A中）为了保证蛋白质为RNA结合蛋白，作者选用Fig1F中的方法里，至少两个超富集肽检测到的蛋白质，以保证它们可在交联细胞中被发现（Fig3A）。这就是高置信度RNA结合蛋白质组，即MCF7的1207个蛋白、HeLa的1239个蛋白和HEK293细胞的1357个蛋白，且其中858个为三个细胞系共有。（Fig3B）然后作者将其与目前已知的多聚腺苷RNA结合蛋白组对比，发现在Hela细胞中，其与mRNA互作组及候选mRNA互作组均存在部分重叠。（Fig3C）作者在MCF7及HEK293细胞系中得到了类似的结果，并且，加上对非多聚腺苷互作体部分的GO分析数据，超过80%的蛋白质与RNA或核糖核苷酸相互作用。（Fig3D）结合所有三个细胞系的研究，作者选出1753个蛋白，将其命名为整合的人RNA结合蛋白质组或ihRBP，包含978个蛋白质（70%）的多聚腺苷互作体和775个非多聚腺苷互作体。（Fig3E）接下来，作者就ihRBP中氨基酸进行分析，发现了由交替的R和E、R和S、R和G组成的六肽以及六(G)。（Fig3F）然而，多聚腺苷相对于非多聚腺苷的RNA更频繁地包含特定的低复杂度序列，更疏水，且具有偏碱性的等电点。（Fig3G）多聚腺苷和非多聚腺苷相互作用蛋白质组共性和差异都十分显著。（Fig3H）
4. 亚砷酸盐对蛋白质组的影响
接下来，作者探究加砷条件下蛋白翻译的变化情况。亚砷酸盐诱导产生的翻译减少在10分钟后已经明显，30分钟后趋于平稳。（Fig4A）对于大多数蛋白质，总的蛋白质表达水平没有改变，然而，一个明显的蛋白质亚群显示出丰度逐渐降低。（Fig4B）GO分析表明，在亚砷酸根处理5min后，下调的蛋白质在蛋白翻译相关分组内大量出现。（Fig4C）进一步研究发现，下调的为胞质核蛋白体，而非线粒体核蛋白体。（Fig4D）Western blot结果确证砷诱导后自噬潮增加。（Fig4E）用自噬抑制剂spautin-1预处理后，砷诱导产生的蛋白水平下调即得到减轻。（Fig4F）以上说明亚砷酸盐刺激导致蛋白翻译阻滞。
5. 亚砷酸盐介导的翻译阻滞对总蛋白和RNA相互作用蛋白组的影响
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