全文编译！复旦大学张永振课题组发表Nature论文揭示新型冠状病毒2019-nCoV与中国正在爆发的人类呼吸道疾病有关

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

2020年2月4日讯/生物谷BIOON/---严重急性呼吸综合征（SARS）和寨卡（Zika）等新兴传染病对公共卫生构成了重大威胁。尽管进行了广泛的研究，但是如何、何时和何地出现新疾病仍然具有相当大的不确定性。最近在中国湖北省武汉市报道了一种严重的呼吸系统疾病。自第一位患者于2019年12月12日住院以来，截至2020年1月25日，已报道了至少1975例病例。流行病学调查提示着此次疫情爆发与武汉的一家海鲜市场有关。

在一项新的研究中，来自中国复旦大学、中国疾病预防控制中心、华中科技大学和武汉市疾病预防控制中心的研究人员研究了一名在这家海鲜市场工作的患者，该患者于2019年12月26日入住武汉市中心医院，出现了严重的呼吸综合征，包括发烧、头晕和咳嗽。相关研究结果于2020年2月3日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“A new coronavirus associated with human respiratory disease in China”。重要的是，Nature期刊在2020年1月7年收到这篇论文的手稿，1月28日就接受了这篇论文，并以“加快评审文章（Accelerated Article Preview）”的形式在线发表了这篇论文。论文通讯作者为复旦大学公共卫生学院张永振（Yong-Zhen Zhang）教授。

这名接受研究的患者是一名41岁的男性，无肝炎、结核病和糖尿病病史。他在病发六天后即2019年12月26日入住武汉市中心医院。这名患者在就诊一周后就出现发烧、胸闷，无力咳嗽、疼痛和虚弱。心血管、腹部和神经系统检查均正常。观察到轻度的淋巴细胞减少（每立方毫米少于900个细胞），但在全血细胞计数（CBC）测试中，白细胞和血小板计数正常。在血液化学测试中，观察到C反应蛋白（CRP，血液41.4 mg/L，参考范围0～6 mg/L）升高，并且天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶的水平略有升高。动脉血气（ABG）测试显示这名患者患有轻度低氧血症，血氧水平为67mmHg。在入院的第一天（发病后第6天），胸部X线照片异常，伴有气腔阴影，如磨玻璃样阴影（ground glass opacity），双肺局灶性实变和斑片状实变。CT扫描显示双侧局灶性实变、大叶性实变和斑片状实变，尤其是下肺。胸部X线照片显示入院后第5天（发病后第11天）双侧弥漫性斑块状的模糊阴影。

通过商业病原体抗原检测试剂盒开展的初步病原学调查排除了流感病毒、肺炎衣原体和肺炎支原体的存在，并利用PCR进行了确认。其他常见的呼吸道病原体，包括腺病毒，通过qPCR测试也是阴性。尽管进行了抗生素、抗病毒药物和糖皮质激素的联合治疗，但是这名患者表现出呼吸衰竭，并接受了高流量无创通气。在治疗三天后，这名患者的病情没有改善，被送进了重症监护室（ICU）。这名患者入院6天后被转移到武汉的另一家医院接受进一步治疗。

武汉市疾病预防控制中心流行病学调查显示，这名患者在当地的一家室内海鲜市场工作。值得注意的是，除鱼类和贝类外，在这次疫情开始之前，这家海鲜市场上还出售各种活的野生动物，包括刺猬、獾、蛇和鸟类（斑鸠），以及动物尸体和动物肉。没有蝙蝠在销售。尽管这名患者可能与这家海鲜市场上的野生动物接触过，但是他回忆说，他没有接触活禽。

为了研究与这种疾病相关的可能病原体，这些研究人员收集了支气管肺泡灌洗液（BALF）并进行了深度宏转录组测序。这名患者的临床样本在上海公共卫生临床中心的生物安全3级实验室中进行处理。从200μl BALF样本中提取总RNA，并使用Illumina MiniSeq进行双端（150 bp）测序，从而构建出宏转录组文库。他们总共产生了56565928个读取序列（sequence read），从头开始组装这些读取序列并筛选潜在的病原体。在利用Megahit组装出的384096个片段重叠群（contig）中，最长的片段重叠群（30474个核苷酸[nt]）具有很高的丰度，并且与之前在中国采样获得的蝙蝠SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZC45（GenBank登录号MG772933）具有密切的亲缘关系，核苷酸序列同一性为89.1％。这种新型病毒的基因组序列及其末端分别通过RT-PCR9和5'/3' RACE Kit（TaKaRa）加以确定和确认。它被命名为WH-Human 1冠状病毒（WHCV，也被称为2019-nCoV）。它的全基因组序列（29903 nt）的GenBank登录号为MN908947。将这些RNA测序（RNA-seq）数据与这种组装出的WHCV完整基因组进行重新映射导致123613个读取片段发生组装，并且在平均深度为6.04X（范围：0.01X-78.84X）的条件下可实现99.99％的基因组覆盖率。定量PCR（qPCR）估计BALF样本中的病毒载量为3.95×108拷贝/mL。

通过与β冠状病毒属的两个代表性成员---人类起源的冠状病毒（SARS-CoV Tor2，AY274119）和蝙蝠起源的冠状病毒（Bat-SL-CoVZC45，MG772933）---进行序列比对，这些研究人员描述了WHCV的病毒基因组结构特征。基于这种序列比对和开放阅读框（ORF），对WHCV的非翻译区（UTR）和ORF进行了定位。WHCV病毒基因组类似于这两种冠状病毒（图1），它的基因次序为：5'-replicase ORF1ab-S-envelope(E)-membrane(M)-N-3'。WHCV具有典型的β冠状病毒的5'和3'末端序列，5'末端有265 nt，3'末端有229 nt。这个预测的WHCV ORF1ab基因（编码复制酶）长度为21291 nt，包含16个预测的非结构蛋白（NSP），随后是（至少）13个下游ORF。此外，WHCV和SARS-CoV在nsp1中具有一个高度保守的结构域（LLRKNGNKG：氨基酸122-130）。WHCV的S、ORF3a、E、M和N基因的预测长度分别为3822 nt、828 nt、228 nt、669 nt和1260 nt。除了Sarbecovirus亚属的所有成员都具有这些ORF区域之外，WHCV与SARS-CoV之所以相类似是因为它携带一个预测的位于M基因（编码包膜蛋白的ORF）和N基因之间的ORF8基因（长度为366 nt）。WHCV ORF的功能是根据已知的冠状病毒序列预测的。与SARS CoV Tor2类似的是，一个前导转录调控序列（TRS）和9个假定的TRS可以很容易地在WHCV ORF的5’端上游鉴定出来，其中假定的保守性TRS核心序列以两种形式---ACGAAC和CUAAAC---之一出现。