高通量单细胞转录组测序助力解析圆锥角膜的发

作者：张馨予

　　2022年7月12日，山东第一医科大学史伟云教授和高华教授团队于Cell Discovery（IF：38.079）在线发表了眼科疾病圆锥角膜单细胞测序的最新研究成果。作者对3例圆锥角膜患者中获取的中央角膜组织和4例健康对照者的中央角膜组织进行了10x Genomics高通量单细胞转录组测序，绘制了圆锥角膜的单细胞图谱，强调了角膜基质细胞在圆锥角膜形成中的关键作用，为深入理解圆锥角膜的发病机制提供了重要参考。

　　研究背景

　　圆锥角膜是在青少年中常见的角膜扩张性疾病，可导致进行性的视力下降甚至失明。角膜移植是治疗圆锥角膜最后可行的方案，但是给患者和社会带来了沉重的负担。尽管患病率很高，但其病因尚不完全清楚。

　　本研究对来自圆锥角膜患者和健康个体中央角膜的39214个细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）分析，以确定角膜中不同细胞类型在该疾病进展中的变化。本研究有助于理解圆锥角膜发病的分子机制，为圆锥角膜的预防和诊疗提供了新的见解。

　　期刊：Cell Discovery

　　影响因子：38.079

　　发表年月：2022年7月12日

　　材料：3例圆锥角膜患者中获取的中央角膜组织和4例健康对照者的中央角膜组织

　　方法：10x Genomics高通量单细胞转录组测序

　　研究结果

　　1. 圆锥角膜和健康角膜的细胞类型鉴定

　　为了全面了解患者的圆锥角膜和健康人正常角膜的细胞多样性和分子特征，研究从板层角膜移植术(DALK)后的圆锥角膜患者中获取3个中央角膜组织，从健康对照者中获取4个对照的中央角膜组织。将每个样本的组织分离，分别进行10X Genomics的scRNA-Seq(图1A)。所有圆锥角膜患者严重程度的评分均为5分。圆锥角膜表现为圆锥顶部突出和变薄、矢状曲率等病理生物学特征（图1B, 1C)。

　　经过严格质量控制步骤和去除双细胞，所有样本共获得39214个细胞，其中20312个细胞来自圆锥角膜，18902个细胞来自健康角膜，平均每个细胞有3339个基因和18247个转录本。所有样本的细胞被划分为6个细胞群（图1D），根据经典的特异性标记基因将6群细胞注释3种细胞类型，即角膜上皮细胞(CEC，表达KRT3、KRT12和KRT14)，角膜基质细胞(CSC，表达DCN、KERA和LUM)以及少量免疫细胞(ImC，表达CD45) (图1E, 1F)。

　　此外，研究分析了细胞类型特异性的生物学功能。三种细胞类型在圆锥角膜和健康角膜样本中的比例没有显著差异(图1I,1J)，表明在圆锥角膜的病理机制中，细胞的基因表达异常可能比细胞比例的改变更为重要。

　　图1 | scRNA-Seq分析人圆锥角膜和健康角膜的细胞组成

　　2. 圆锥角膜细胞类型特异性的转录信号改变

　　研究比较了圆锥角膜和健康角膜中每种细胞类型的转录特征。有340个上调基因和422个下调基因在至少一种细胞类型中被检测到，大多数差异基因表现为细胞类型特异性的特征(图2A)。角膜基质细胞上调的基因参与胶原代谢过程和细胞外基质降解，符合圆锥角膜降解和基质变薄的临床表现；角膜上皮细胞上调的基因参与“角质化”和“上皮细胞分化”等过程；免疫细胞上调的基因参与免疫相关过程，如白细胞迁移和炎症反应(图2B)。作者从OMIM Clinical Synopsis (https://www.omim.org)下载了136个圆锥角膜相关基因，结合scRNA-Seq鉴定的细胞类型，绘制了细胞类型特异性的圆锥相关基因的表达谱，且发现角膜基质细胞中富集的圆锥相关基因比例最高(图2C)。

　　接下来，作者比较了已知的圆锥角膜相关基因（胶原家族成员、细胞外基质和基质金属蛋白酶相关基因）在不同细胞类型中特异性的表达模式。几乎所有胶原基因在基质细胞中均表达丰富，COL5A1、COL5A3等基因在圆锥角膜组下调，解释了圆锥角膜疾病中胶原纤维减少的原因；细胞外基质基因在圆锥角膜组的基质细胞中广泛下调；基质金属蛋白酶相关基因在圆锥角膜组的基质细胞中上调(图2D)。有趣的是，作者发现胶原家族成员、细胞外基质和基质金属蛋白酶相关基因并不局限于基质细胞，某些基因在其他细胞类型中差异表达，表明所有类型的角膜细胞均可能在圆锥角膜的细胞外基质失调中发挥重要作用。