4例新生儿顽固性水样腹泻病例，都与基因有关

作者：张馨予

原创黄志恒儿科黄哥黄医生
新生儿腹泻，特别是顽固性腹泻，是在出生后的最初几周会出现症状。
新生儿腹泻的病因多种多样，例如从简单的牛奶蛋白过敏、乳糖不耐受到危及生命的肠道问题，例如先天性腹泻和肠病。
先天性腹泻和肠病
还有一类新生儿腹泻是先天性腹泻和肠病，它是由遗传性疾病引起的，与病原体感染和食物蛋白过敏引起的获得性腹泻不同。这些遗传性疾病是罕见的，尚未确定这些患者的有效治疗选择。先天性腹泻和肠病的特点是在生命的最初几周出现剧烈腹泻，这可能导致肠衰竭。
大多数先天性腹泻和肠病是单基因的，可分为五个主要类别：
(a) 小肠上皮营养物质和电解质转运缺陷，例如先天性氯化物腹泻 (CCD) 和葡萄糖-半乳糖吸收不良；
(b) 小肠上皮酶和代谢缺陷，例如先天性乳糖酶缺乏症和乳糜微粒潴留病；
(c) 小肠上皮运输和极性缺陷，例如微绒毛包涵体病 (MVID) 和先天性簇绒性肠病 (CTE)；
(d) 肠内分泌细胞功能障碍，例如肠内分泌失调；
(e) 与免疫失调相关的肠病，例如 IPEX（免疫失调、多内分泌病、肠病、X 连锁）综合征。先天性氯化物腹泻、微绒毛包涵体病和先天性簇绒性肠病的主要临床表现是出生后头几个月内出现大量水样腹泻。
尽管许多病例被强烈怀疑是先天性腹泻和肠病，但没有基因检测就无法确定具体病因。延迟诊断可能导致不可逆转的并发症和明显高的发病率和死亡率。因此，必须及早发现这些疾病，以预防并发症。下一代基因测序通过调查导致先天性腹泻和肠病的单基因疾病的遗传基础并允许及早开始适当的治疗，为该领域的巨大进步做出了贡献。
在这项研究中，我们报告了 4 例出现新生儿水样腹泻并携带单基因突变的患者，包括 2 例先天性簇绒肠病、1 例微绒毛包涵体病和1例先天性氯化物腹泻。我们还回顾了已在东亚报道的溶质载体家族 26 成员 3 ( SLC26A3 )、上皮细胞粘附分子 ( EPCAM ) 和肌球蛋白 VB ( MYO5B ) 的遗传变异情况。
患者 1
患儿，男孩，在 23 个月大时转入我院。孕34周剖宫产，出生体重2600克。他有一个12岁的健康姐姐。
患者在出生后第 10 天开始出现顽固性腹泻。由于反复出现电解质紊乱、腹胀、呕吐和败血症，他不得不多次住院。治疗包括抗生素（哌拉西林/他唑巴坦、头孢美唑、头孢他啶+甲硝唑或万古霉素）、益生菌、蒙脱石和胰酶，但患者病情没有改善。患者入院时出现严重的生长迟缓，体重 6.8 公斤（Z 评分-4.71），身高 70.5 厘米（Z 评分-5.35）。
入院时的初步实验室检查显示血清肝酶、肌酐、免疫球蛋白、甲状腺激素水平正常，自身免疫抗体阴性，全血细胞计数正常。包括沙门氏菌、志贺氏菌和霍乱在内的肠道病原体检测结果均为阴性。结肠镜检查未见明显异常。与同龄患者相比（图 1A），上消化道内镜检查显示十二指肠黏膜绒毛萎缩（图 1B）。
图。13名患者的内镜表现。
A图健康的 2 岁儿童的十二指肠降部正常黏膜
B图 26 个月时患者 1 的十二指肠黏膜绒毛萎缩
C、D图 43 天时，患者 2的十二指肠 ( C ) 或回肠末端 ( D ) 没有明显的明显异常
E、F图在 71 天时，患者 4的十二指肠 ( E ) 或回肠末端 ( F ) 没有明显的明显异常
停止肠内营养后，孩子的排便量降至 390 克/天。在重新引入肽配方后，粪便产量增加到 505-1230 克/天。
2017 年11 月至2018 年 8 月，他经历了7次脓毒症发作。由于钡灌肠检查发现结肠扩张，并考虑诊断为复发性肠源性脓毒症，因此进行末端回肠造口术以使结肠休息。活检组织的苏木精-伊红染色显示绒毛扁平、隐窝增生、表面上皮组织紊乱和绒毛尖端的簇（图 2）。透射电子显微镜 (TEM) 显示微绒毛数量减少和杂乱无章的细胞连接 (图 3 A、B )。
图 2患者1
A图肠道活检的 H&E 染色。簇绒或泪珠外观；26 个月时结肠中嗜酸性粒细胞和浆细胞的浸润。
B图 27 个月时空肠活检显示萎缩绒毛，上皮细胞拥挤形成簇。
C图 27 个月时回肠活检中绒毛缩短、增殖性上皮细胞紊乱、局灶性簇绒和隐窝增生。
D图 27 个月时结肠出现簇绒或泪珠状外观和隐窝增生。
E图绒毛变钝；在 40 个月时，在造口附近的回肠绒毛尖端簇绒毛。
F图慢性黏膜炎症；簇绒或泪珠外观；40 个月时结肠固有层炎症细胞浸润图 3
对三名患者的肠道组织进行透射电镜描。
A , B图患者 1 空肠中微绒毛的局灶性丢失和杂乱无章的细胞连接
C、D图扁平微绒毛；患者 2 回肠中肿胀的上皮细胞和轻微扩张的内质网
E、F图微绒毛的局灶性丢失；患者 4 回肠中肿胀的上皮细胞
在 34 个月时接受 Bishop Koop 回肠造口术并接受粪便微生物群移植 (FMT) 后，患者的粪便输出量从每天143 克波动到 452 克。由于使用基于肽的配方和肠外营养 (PN) 支持进行鼻空肠喂养，他的营养状况显着改善。患儿最后一次出院时 40 个月时体重为 12.5 kg（Z 评分-1.55）。不幸的是，他在 3.5 岁时因对输血的严重反应在当地一家医院去世。
全外显子组测序结果证实，患者 1 的EPCAM基因 (NM_002354) 中存在新的复杂突变。患者的母亲是第2内含子突变 (c.184+6T>G) 的杂合携带者(NM_002354.2)，被归类为“致病”。使用 eXome-Hidden Markov 模型程序预测在他父亲的 2 号染色体 (chr2:47596623–47613791) 中有一个 17.168 kb 的大缺失。患者从无症状的父母那里继承了两种遗传异常。对姐姐的 DNA 进行测序时，没有检测到突变。
病人 2
患儿2，男孩，在 17 天大时被送入新生儿重症监护室。他在妊娠 40 周通过阴道分娩出生时体重为 3340 克。他在出生后 3 天内出现持续的、每天 10 次以上的水样、非血性腹泻大便。
除了白细胞数量升高和代谢性酸中毒外，当孩子入院时，肝功能、肾功能、免疫球蛋白水平、甲状腺激素、自身免疫抗体或感染性病因未检测到其他异常发现。43天时进行了胃肠内镜检查，但未发现明显的肉眼表现（图 1C、D）。活检的 H&E 染色显示绒毛萎缩和拥挤的上皮细胞（图 4 A-C）。图 4
来自患者 2-4 的肠道活检的 H&E 染色。
A图患者 2 的十二指肠活检中绒毛扁平、杂乱无章的上皮。
B图来自患者 2 (200×) 的末端回肠黏膜活检中的绒毛萎缩和拥挤的上皮细胞。
C图慢性炎症；患者 2 的结肠绒毛萎缩。
D图患者 3 的回肠绒毛正常高度 (200×)。
E图患者 3 的结肠中充血、水肿和淋巴细胞聚集物。
F图充血、水肿和明显的淋巴细胞浸润；患者 4 十二指肠绒毛变钝
禁食导致腹泻症状暂时缓解，但在摄入氨基酸配方后，排便量增加到 600 克/天。该患者在我院住院 1 个月期间发生了 1 次脓毒症发作。孩子出院后已经进行了一年多的部分PN，但在他的第一个生日时体重只有3.3公斤。
在患者 2 中检测到EPCAM基因第2外显子 (c.96 C>A; p.Y32*) 和第7外显子 (c.823delG; p.V275W fs*2) 中出现新的复杂杂合突变。c.96 C > A遗传自他母亲的突变和 c.823delG 突变遗传自他父亲。根据美国医学遗传学和基因组学/分子病理学协会 (ACMG/AMP) 2015 年指南，这两种变异都被归类为“可能致病”。
患者 3
一名 3 个月大的男婴因发育迟缓和顽固性腹泻入院。患者孕35 +5周出生，体重3020g，在我院阴道分娩。
产前成像显示在妊娠 24-26 周时肠袢扩张和羊水过多（图 5 A、B) 和 I 级胎粪染色的羊水在出生时被注意到。无相关家族史。婴儿每天大便 3-5 次，但出生后仍出现腹胀。钡灌肠造影后怀疑肠狭窄。
在出生4 在远端回肠进行肠切除和 Bishop Koop 回肠造口术。H&E 染色发现回肠或结肠中没有绒毛萎缩的炎症变化（图 4 D、E）。从外科出院后，他反复出现水样腹泻和发育迟缓。他在 3 个月大时体重仅为 3.5 公斤（Z 评分-4.12），身长为 55 厘米（Z 评分 - 3.18），当时他因发育不良而被转移到我们部门。
图 5患者 3 的产前成像。
A图在妊娠 24 周时通过超声可以看到扩张的胎儿肠袢和羊水过多。
B图 MRI 扫描证实在妊娠 26 周时存在羊水过多和胎儿弥漫性肠扩张
在 3 个月大时，当他被转诊到我们科时，患者的实验室检查显示典型的低氯性代谢性碱中毒、低钠血症和低钾血症。其他检查结果正常，包括肝功能、肾功能、粪便病原体、免疫球蛋白水平、甲状腺激素和全血细胞计数。
婴儿通过鼻胃间歇喂养广泛水解配方奶粉，并补充钾，缓解腹泻，纠正碱中毒和缺钾。他能够独立坐下，体重在 7 个月大时增加到 7.5 公斤（Z 评分 - 0.92）。
患者 3 的测序结果证实了SLC26A3基因中存在复合杂合突变（c.269_270 dupAA 和 c.1696 C > T）。患者的母亲是 c.269_270 dupAA 突变 (p.G91Kfs*3) 的杂合子携带者，而 c.1696 C > T 突变 (p.R566*) 由父亲携带。根据 AMCG/AMP 2015 指南，这两种变体都被归类为“致病性”，引起先天性氯化物腹泻。
患者 4
一名 42 天大的男孩因中度脱水和嗜睡入住 NICU。他在妊娠 40+3 周时通过阴道分娩，出生时出生体重为 3300 克。他的父母和 11 岁的妹妹都很健康。出生后 28 天，他出现腹泻。他的大便呈水样，每天排便超过 10 次。
初步测试结果显示丙氨酸转氨酶、代谢性酸中毒和低钾血症水平升高。粪便病原体检测阴性。患者根据感染适应症给予不同抗生素（头孢美唑、头孢吡肟+甲硝唑、万古霉素+美罗培南）治疗。其他治疗包括蒙脱石散、消旋卡多曲、保肝和 PN。
然而，经过一个月的治疗，并没有明显改善。患者随后被转诊至儿科胃肠病学和营养科，并接受了内镜检查（图 1 E、F）。H&E 染色结果显示，双侧十二指肠绒毛变钝（图 4 ）F) 和回肠活检。TEM 分析未显示末端回肠活检中的任何典型包涵体（图 3 E、F）。
2月龄时，患者因反复发作接受机械通气3天，并给予抗癫痫药物治疗，表现为面部和四肢反复肌肉痉挛。当癫痫发作和败血症得到良好控制时，他以 4.1 公斤的体重出院。
患者 4 中发现了MYO5B在基因复合杂合突变是，突变位点 c.1306 G > T (p.V436F)从父亲遗传， c.3190 C > T (p.R1064*)，从母亲遗传。这两种变体以前都没有在人类基因突变数据库 (HMGD) 或 PubMed 数据库中描述过。
东亚突变回顾
作者回顾了东亚英语或汉语报告的SLC26A3、EPCAM和MYO5B突变。根据文献检测到34个SLC26A3突变。其中，第3外显子c.269_270 dupAA（p.G91Kfs*3）突变是我国7例CCD患者中最常见的遗传异常。相比之下，韩国和日本的报道显示，18号内含子的c.2063-1G>T突变是最常见的改变，存在16例。大多数 CCD 患者携带外显子 3-5、外显子 9 和内含子 18 的突变。迄今为止，东亚地区很少报道EPCAM和MYO5B变体。九个EPCAM已在先天性簇绒肠病患者中鉴定出突变，其中 3 个位于外显子 3。
新生儿腹泻的诊断和管理尤其具有挑战性。常见病因包括胃肠道食物过敏、感染、先天性肠细胞缺陷、肠内分泌细胞功能障碍和免疫失调相关的肠病。出现顽固性早发性腹泻的病例，可能导致肠功能衰竭，应怀疑为先天性遗传疾病。考虑到这一点，基因组医学的进步可用于帮助医生确定这些疾病的精确诊断。
先天性簇绒肠病
先天性簇绒肠病是一种罕见的常染色体隐性遗传性肠病，表现为顽固性新生儿腹泻、严重营养不良和肠功能衰竭。在西欧，先天性簇状肠病的发病率估计约为 50,000-100,000 例活产中的 1 例。组织学检查先天性簇状肠病患者的肠组织时，结果显示绒毛萎缩，基底膜异常，绒毛尖端上皮肠上皮细胞“簇”。然而，H&E 染色显示的典型的簇状在生命的最初几个月很难检测到。同样，在本研究中，这些典型的簇状在患者1中很明显，但在患者2中不明显。
发现EPCAM基因（编码上皮细胞粘附分子）和丝氨酸肽酶抑制剂 Kunitz 2 型 ( SPINT2 ) 基因的变异与先天性簇绒肠病相关。EPCAM表达缺失会破坏紧密连接，导致肠道屏障通透性增加和离子转运减少，从而导致腹泻。EPCAM 外显子5 中的 c.498 insC 突变是中东地区最常见的纯合突变。外显子 3 中的突变在人群以及东亚地区更为广泛和可变。
先天性簇状肠病患者的表型差异很大。一些病例与多种关节炎或畸形有关，包括畏光、角膜炎、白内障、后孔闭锁和心肌病。据报道，先天性簇状肠病患者可能有超过 92% 的长期生存机会，并且 75% 的患者可以在 25 岁前摆脱肠外营养 (PN) 。勒马尔等人发现，从 PN 断奶的患者随着时间的推移表现出组织学病变的改善。
复旦大学附属儿科医院黄瑛教授课题组 2018 年报告了中国首例先天性簇绒肠病
病例。在这项研究中，在两名先天性簇状肠病儿童中发现的新型EPCAM突变。进一步证明EPCAM基因参与了先天性簇状肠病的发病机制。
2020年浙江大学附属儿童医院也报道1例先天性簇绒肠病患儿。该患儿1岁7个月大，出生后1周内出现难治性水样腹泻和大便糊状，为此多次就医和住院治疗。他的姐姐也出现了类似的症状，并在两岁时去世。入院时，他的体重为5700克（-4.8SDS），身高66厘米（-5.4SDS）。与此同时，他不能说话或爬。他表现出轻度贫血，低钙血症，低镁血症和上呼吸道感染。小肠活检报告了上皮细胞的微绒毛稀疏和空泡变性。全外显子组测序显示EPCAM基因中出现一种新的纯合子剪接突变（c.657+1[IVS6] G>A）。他接受了TPN和重组人类生长激素治疗。2个月后，他的体重高达8500克，他一直在等待小肠移植。外显子测序使我们能够更早地识别组织学未检测到典型簇的患者2的先天性簇绒肠病。我们假设迄今为止，中国的先天性簇状肠病患病率可能被低估了。
先天性氯化物腹泻
先天性氯化物腹泻以常染色体隐性遗传方式遗传，表现为胎儿期开始的大量、酸性、水样、大量腹泻，并伴有低氯性代谢性碱中毒。一般来说，产前检查往往会发现胎儿弥漫性肠扩张和宫内腹泻引起的羊水过多，这与肠梗阻非常相似。粪便氯化物水平高（> 90 mmol/L）可作为初步诊断的预测指标。先天性氯化物腹泻的管理包括终生补充氯化物和在患者排便量增加时补充液体。
先天性氯化物腹泻的致病特征与溶质载体SLC26A3基因的单基因突变有关。该基因编码耦合的氯化物/碳酸氢盐 (Cl–/HCO3–) 交换剂，它与钠/氢交换剂（Na + /H + 交换剂，NHE）一起发挥作用，并且是电中性钠吸收所必需的，特别是在回肠和冒号。SLC26A3突变导致肠道钠驱动的液体吸收丧失，导致远端回肠氯化物丢失、碳酸氢盐潴留和低氯代谢性碱中毒。低钾血症主要归因于肾素/血管紧张素/醛固酮系统的激活。
小西等人报道了一项针对日本确诊先天性氯化物腹泻患者的多机构调查。大部分患者（62%）每天大便少于 5 次，婴儿期后均较少。只有 38% 的患者需要长期补充钠、钾和氯。除了一名患者外，他们的神经发育总体良好。另一名患者患有肾钙质沉着症，三名患者 (23%) 出现轻度慢性肾病。在 14 名患者中的 13 名 (93%) 中鉴定出纯合或复合杂合SLC26A3变体。
我们注意到患者 3 可能在 6 个月大之前被误诊为肠狭窄。尤其要注意的是，产前羊水过多和大肠扩张的病例也可能怀疑先天性氯化物腹泻，以免误诊为肠梗阻而进行不必要的手术。c.269_270 dupAA (p.G91Kfs*3) 突变也被描述为 c.269_270 insAA 或 c.268_269 insAA，这是之前在中国 6 名患者中报道的最常见的突变。其他研究人员于2019年7 月13 日在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp (rs1018933248)上发布了一个新描述的变体 c.3190C>T (p.R1064*) 。
微绒毛包涵体病
微绒毛包涵体病是一种罕见的常染色体隐性腹泻病，与微绒毛内的上皮运输缺陷相关，会导致剧烈腹泻，导致代谢性酸中毒、电解质异常和发育迟缓。该病的病理特征包括绒毛萎缩、微绒毛变钝或缺失，以及肠细胞中的包涵体。
需要注意的是，包涵体的识别需要重复的透射电镜分析，并且出现的频率可能非常低。一些患有微绒毛包涵体病的人没有表现出典型的微绒毛包涵体，但确实表现出其他肠上皮细胞异常。微绒毛包涵体病患者需要长期 PN，最终可能会转诊进行肠移植。
据报道， MYO5B、STXBP2和STX3中的各种突变与 MVID相关。MYO5B _基因编码基于肌动蛋白的运动蛋白，肌球蛋白VB。肌球蛋白 VB、RAB11A 和 RAB8A 与顶端再循环内体 (AREs) 相关，并在上皮极性的发展中发挥重要作用。通过免疫染色试验在微绒毛包涵体病中证实了小肠中 RAB11A 和 RAB8A 依赖性 ARE 的损伤。肌球蛋白 VB 和 RAB11A 在 MVID 肠细胞中均错误定位。ARE 中的缺陷导致微绒毛萎缩以及营养和离子吸收所需的酶和转运蛋白在细胞内的滞留。这些具有功能失调的微绒毛的肠细胞无法吸收营养和液体，导致 MVID 患者出现严重腹泻。
在这项研究中，患者 4 出现顽固性水样腹泻、代谢性酸中毒、电解质异常和肝功能障碍，但透射电镜未检测到包涵体。全外显子测序技术帮我们识别该患者为微绒毛包涵体病。
在高通量测序技术临床应用取得突破后，越来越多的病例被证实为先天性腹泻病。然而，这些罕见的病因尚未得到中国儿科医生和病理学家的充分认可。希望这些关于先天性氯化物腹泻、微绒毛包涵体病和先天性簇绒性肠病的报告将增加基因型-表型相关性的范围，并帮助更多的儿科医生识别此类疾病。
新生儿水样腹泻患者的病因很难根据临床表现和组织学评估来诊断，尤其是在他们生命的早期。通过这项研究，我们描述了 4 例新生儿水样腹泻患者的临床表现和遗传分析。分别在两名儿童的EPCAM基因和另一名男孩的MYO5B基因中发现了新的复合突变。此外，我们回顾了在东亚报道的SLC26A3、EPCAM 和 MYO5B的遗传变异。揭示c.269_270 dupAA（p.G91Kfs*3）是中国最常见的SLC26A3突变。EPCAM和MYO5B遗传变异仅在东亚零星报道。基于基因分析的早期诊断对于获得更好的预后至关重要，从而改善治疗。未来的研究应该探索本研究中发现的新突变的功能效应。
参考文献：
Monogenic mutations in four cases of neonatal-onset watery diarrhea and a mutation review in East Asia.Yan W, Xiao Y, Zhang Y, et al.Orphanet J Rare Dis. 2021 Sep 9;16(1):383.
New mutation in EPCAM for congenital tufting enteropathy: A case report.Zhou YQ, Wu GS, Kong YM, Zhang XY, Wang CL.World J Clin Cases. 2020 Oct 26;8(20):4975-4980.
黄医生关注儿童胃肠道疾病10多年，擅长儿童腹泻、腹痛、便秘、牛奶蛋白过敏、嗜酸细胞胃肠炎，炎症性肠病、急慢性胃炎、喂养困难、进食障碍、营养不良等多种疾病。