一种蛋白质热稳定性检测芯片的制备方法、检测

作者：张馨予

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒药物靶点蛋白质稳定性高通量检测芯片以及试剂盒。

背景技术：

2.蛋白质参与疾病的发生和发展过程，可以作为疾病靶标来开发特异性药物起到治疗的效果。以蛋白质作为药物靶点的药物筛选方法有很多种，例如基于sp r(surface plasmon resonance)技术、等温滴定量热技术itc(isothermal titra tion calorimetry)等，但是这些方法也存在缺点。首先，检测通量低，每次(批) 只能检测少数样本；其次，仪器设备造价高，属于专用设备，不具有通用性。
3.中药具有组方快，副作用小的特点，在面对新型冠状病毒早期可以快速应用救治患者。中药具有先临床应用后药理研究的特点，目前一些疗效确切的中药和天然产物缺乏相关的靶点研究工具。
4.现有技术中目前没有直接检测蛋白质与药物相互作用且可以实时检测的基于蛋白热稳定性原理的蛋白质芯片，也没有针对新型冠状病毒的药物靶点作用分子筛选的蛋白质芯片和试剂盒。研究与开发新的使用方便、高通量、可实时监测的检测蛋白质与药物分子相互作用的方法和产品，是解决上述问题的关键。

技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种基于蛋白质热稳定性的蛋白质芯片并进行了条件优化和针对新冠病毒靶点的试剂盒建立，可以实现在常规pcr仪器上实现高通量非标记的新冠病毒靶点药物筛选。
6.本发明基于蛋白质热稳定性，利用蛋白质热转移分析去开发新的高通量检测产品和试剂盒。分子(此处包含蛋白、抗体、小分子药物、中药复杂成分体系) 与蛋白发生相互作用时，蛋白质的构象大多会发生变化，进而其稳定性就会发生改变。蛋白质热转移分析是基于蛋白质结构的疏水性部位随着温度的上升，逐渐暴露出来的原理，通过荧光素与蛋白质疏水性部分的结合，以荧光量随温度上升而变化的曲线形式，揭示特定蛋白质在稳定性上的特性。目前针对蛋白热稳定性检测的产品和技术都是单通道的，尚没有实现高通量的检测，疾病的治疗靶点往往是众多的，这使得该方法无法进行多靶点的高通量的药物筛选和未知靶点药物的靶点筛选。
7.基于上述问题和科学原理，本专利首次提出一种结合蛋白质热稳定性分析和生物芯片原理的筛选新型冠状病毒药物靶点相关分子的蛋白质热稳定性检测芯片和试剂盒。常规的蛋白质热稳定性是单通道的，据蛋白靶点与药物反应前后热稳定曲线的变化差异，可以判断蛋白是否与药物存在相互作用。本试剂盒新创、优化了制备和检测条件，提高了新冠病毒相关蛋白靶点热稳定性检测的速度和通量。
8.一方面，本发明提供了一种蛋白质热稳定性检测芯片。
9.所述的蛋白质热稳定性检测芯片为高通量靶点蛋白质热稳定性检测芯片。
10.所述的蛋白质热稳定性检测芯片用于筛选作用于新冠病毒靶点蛋白的药物和未知靶点药物的靶点筛选。
11.所述的蛋白质热稳定性检测芯片中包括新冠病毒的潜在靶点蛋白的纯品。
12.所述的靶点蛋白包括经过网络药理学筛选相关的高频药物靶点，包含宿主来源和病毒来源两部分。
13.所述的靶点蛋白的种类至少包括：重组人蛋白ace2、cathepsin b(ctsb)、 cd147、axl、anneixn a2、hmgb1、nfκb1(p50)、mapk1、tab1、重组病毒sars-cov-2 nucleocapsid protein、non-structural protein sars-cov-2nsp2、sars-cov-2 3c-like proteinase。
14.优选地，所述的靶点蛋白的种类包括：重组人蛋白ace2、cathepsin b (ctsb)、cd147、axl、anneixn a2、hmgb1、nfκb1-p50、mapk1、tab1、重组病毒sars-cov-2 nucleocapsid protein、non-structural protein sars-cov-2nsp2、sars-cov-2 3c-like proteinase。
15.进一步优选地，所述的靶点蛋白用于热稳定性检测的序列为seq idno.1-12。
16.优选地，所述的蛋白质热稳定性检测芯片用于热稳定性检测nfκb1(p50) 蛋白工作浓度为0.02-1μg/μl；进一步优选为0.045μg/μl。
17.优选地，所述的ace2、cathepsin b(ctsb)、cd147、axl、anneixn a2、 hmgb1、nfκb1(p50)、mapk1、tab1、重组病毒sars-cov-2 nucleocapsidprotein、non-structural protein sars-cov-2 nsp2、sars-cov-2 3c-like proteinase 用于热稳定性检测的工作浓度分别为0.045-1μg/μl；进一步优选为0.09μg/μl。
18.所述的靶点蛋白用于热稳定性检测的纯度为90％及以上。
19.所述的靶点蛋白保存在保存液中，所述的保存液含有10-30％甘油， ph＝6.7-7.5的磷酸盐缓冲液；所述的保存液中还包括防腐剂和信号增强剂。
20.优选地，所述的保存液含有20％甘油，ph＝7的磷酸盐缓冲液。
21.所述的信号增强剂为0.001-0.1％叠氮化钠；优选为0.01％的叠氮化钠。
22.所述的芯片的载体为反应板，所述的靶点蛋白分布在反应板上。
23.所述的反应板为不含荧光成分的聚丙烯塑料多孔反应板。
24.所述的反应板中每孔含有对应的靶点蛋白体积10μl，浓度为蛋白工作浓度的2倍。
25.所述的蛋白质热稳定性检测芯片制备方法，不同于常规蛋白质芯片的制备方法，该芯片采用聚丙烯塑料多孔板为基片，每个孔为独立的蛋白检测点，采用自动化液体工作站进行批量生产。
26.所述的蛋白质热稳定性检测芯片可长期保存在4℃。
27.所述的蛋白质热稳定性检测芯片可用于检测蛋白、抗体、小分子以及小分子混合物。
28.另一方面，本发明提供了一种用于筛选新型冠状病毒靶点药物的试剂盒。
29.所述的试剂盒中包括前述的蛋白质热稳定性检测芯片。
30.所述的试剂盒中还包括：样品稀释液、荧光染料、质控品、阳性对照品和阴性对照品。
31.所述的样品稀释液为含有10-30％甘油，ph＝6.7-7.5的磷酸盐缓冲液；所述的保存液中还包括防腐剂和信号增强剂。
32.优选地，所述的样品稀释液为含有20％甘油，ph＝7的磷酸盐缓冲液。
33.优选的，所述的荧光染料为5μm的sypro orange。
34.优选的，信号增强剂为质量浓度0.01％的叠氮化钠，同时叠氮化钠具备防腐剂的双重功能。
35.所述的质控品为阳性对照和阴性对照组成。
36.所述的阳性对照品为大分子为0.1μg/μl的新冠病毒n蛋白抗体(购买自上海近岸蛋白有限公司，货号da042)以及100μm的绿原酸单体。
37.所述的阴性对照品为不含药物的0.01m磷酸盐，质量浓度0.01％的叠氮化钠缓冲液。
38.所述的试剂盒可用于有效中药复杂成分的抗新冠病毒作用靶点的直接筛选，其检测方法特征在于中药混合物复杂成分无需标记和分离，中药复杂成分检测经超滤去除蛋白，以靶点蛋白的热稳定性tm数值变化判断是否为中药的靶点。
39.再一方面，本发明提供了前述试剂盒的使用方法。
40.包括以下步骤：
41.(1)制备好的芯片从低温取出至室温、复温30min；
42.(2)准备稀释好的药物样品(10μm)，抗体浓度为0.1μg/μl，中药混合体系稀释比小于1：10，总体积为10μl；
43.(3)将相应的反应板或试管放在冰上，将稀释好的药物加入反应板，反应体系(20μl)；
44.(4)每次反应用移液器(或者自动化加样设备)上下吹吸10次，搅拌均匀；
45.(5)用无荧光光学胶膜密封板，以1000转/分旋转1分钟后，上pcr仪检测，采用荧光定量pcr仪器，特征参数为37-99℃，每0.3℃测一次荧光强度(报告荧光设置成sypro orange染料相对应的参数)；
46.(6)热稳定曲线的数据处理方法，其特征为从pcr仪上导出温度和对应的荧光信号强度，采用作图软件做出样品和对照的蛋白靶点的熔解曲线(温度变化曲线)，标注出两组荧光强度最高点对应的温度tmx(样品)和对照组tmc(对照)，δtm＝tmx-tmc，四个重复孔取平均值；
47.(7)本发明可与自动化液体工作站、机器人设备联用，可形成快速高通量的药物和靶点筛选平台。
48.本发明的有益效果：
49.本发明采用荧光定量pcr与蛋白质芯片理论结合研制出蛋白质热稳定性检测芯片，应用于蛋白质结合的检测中有着通量高、简便快捷、无需标记，实时监控，产品稳定，数据真实可靠的优点，也能同时进行多样本的同时检测，适合推广应用以及联合自动化平台使用，该试剂盒用于筛选新冠靶点蛋白的结合的药物和临床有效药物靶点的筛选，可能有助于新冠的疫情防治和科研。
附图说明
50.图1为蛋白热稳定性检测芯片的原理和应用示意图。
51.图2为蛋白热稳定性检测芯片所用的蛋白种类分布和芯片设计图。
52.图3为蛋白热稳定性检测芯片试剂盒的优选的荧光增强剂结果。
53.图4为蛋白质芯片上所有蛋白的热稳定曲线部分质控结果。
54.图5为蛋白质芯片上所有蛋白的热稳定曲线部分质控结果。
55.图6为小分子药物靶点筛选实验测试结果，an：annexin a2蛋白；cla：绿原酸。
56.图7为大分子药物靶点筛选实验测试结果，nucleocapsid(nucl)：新冠病毒n蛋白；anti-nucleocapsid：新冠病毒n蛋白抗体。
57.图8为中药复方药物靶点筛选实验测试结果，pinellia ternate：半夏水提取物。
具体实施方式
58.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
59.实施例1一种新型冠状病毒药物靶点蛋白质热稳定性检测芯片
60.本实施例的蛋白质稳定性检测芯片原理和应用示意见图1。
61.该特制蛋白质热稳定性检测芯片和试剂盒，在孔板中含有新冠病毒的靶点蛋白的纯品，药物分子用样品稀释液稀释好后加入到反应板的不同区域。
62.样品稀释液为：ph＝7.0的0.01m磷酸盐缓冲液(经过无菌过滤)，以及0.01％的叠氮化钠信号增强剂。
63.采用荧光的定量pcr仪器固定参数进行测量，获得靶点蛋白在有无药物分子情况下的热稳定性曲线，采用本试剂盒的判断是否发生分子相互作用。
64.蛋白质热稳定性检测芯片所用的蛋白种类分布和芯片设计图见图2。
65.反应板上同时固定了多种新冠病毒靶点蛋白，靶点蛋白的种类包括：重组人蛋白ace2、cathepsin b(ctsb)、cd147、axl、anneixn a2、hmgb1、nfκb1-p50、mapk1、tab1、重组病毒sars-cov-2 nucleocapsid protein、 non-structural protein sars-cov-2 nsp2、sars-cov-2 3c-like proteinase共12 个相关蛋白质。保存在4℃。
66.靶点蛋白在大肠杆菌中表达、分离、纯化，得到以上12种特征氨基酸序列 (seq id no.1-12)的重组蛋白，纯度要求达到90％以上。
67.蛋白表达纯化方法如下：
68.蛋白质粒表达采用pet28a质粒，抗性为kana抗性，bl21(de3)为表达菌种；
69.质粒转化到菌种后，不直接进行扩增，而是在经过两轮含有kana抗性的平板上进行单克隆筛选，其具体操作方法为平板稀释划线法。以获得高纯度的单克隆菌株；
70.菌种的扩增程序首先采用1：100的体积比接种到5ml的lb培养基中(kana 抗性，0.05mg/ml)，37℃，170rpm摇菌12小时，再以1：100的体积比接种到500ml lb培养基中(kana抗性，0.05mg/ml)，37℃，170rpm摇菌12小时待菌生长至平台期后再进行iptg诱导，诱导条件的为16℃，170rpm，12小时。
71.菌的收集和破碎流程：菌体离心4000rpm，20min，收集菌体，超声破碎(3s 破碎，1s间歇，50次，超声功率50％)。破碎缓冲液为0.1m的ph＝7.0的磷酸盐，5ml，离心12000rpm，10min，取上清。
72.采用琼脂糖镍填料的重力柱进行纯化，上柱三次，优化后的洗涤条件为100 ml 20mm咪唑洗杂蛋白，洗脱条件1ml 200mm咪唑。
73.芯片的制备流程：采用自动化工作站，按照芯片的设计图，将10μl含有不同靶蛋白终浓度2倍的保存液依次等体积加样，加样完成后进行膜封，放入4℃保存。
74.实施例2一种用于筛选新冠病毒靶点药物的试剂盒
75.包括：实施例1中的蛋白质热稳定性检测芯片、样品稀释液、阳性对照品和阴性对照品。
76.样品稀释液为：ph＝7.0的0.01m磷酸盐缓冲液(经过无菌过滤)，以及0.01％叠氮化钠作为的信号增强剂和防腐剂，5μm的荧光染料。
77.本试剂盒在前期研发过程中，发现荧光信号浓度不强，而使用高浓度蛋白又会带来成本增加问题，另外小分子药物有的也具有自发荧光，会带来较高的背景，同时试剂盒的长期保存也需要防腐剂，为了以上解决以上问题，我们测试了多种化学分子添加剂，并对他们的性能做了测试，测试结果如图3所示。结果表明添加0.01％叠氮化钠能够显著提高检测信号，且不对蛋白热稳定性产生影响，不会带来误差。图3中，buffer 1：纯水；buffer 2：0.01m磷酸盐缓冲液；buffer 3： 0.01m磷酸盐缓冲液+1.5％海藻糖；buffer 4：0.01m磷酸盐缓冲液+1.5％海藻糖 +0.1％5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one,cmit) 和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(2-methyl-4-isothiazloin-3-one,mit)的质量比3:1混合物；buffer 5：0.01m磷酸盐缓冲液+0.01％叠氮化钠。根据测试结果，buffer 5 具有增强荧光信号强度的功能，且不影响蛋白tm值。
78.荧光染料为的sypro orange。
79.阳性对照品为大分子为新冠病毒n蛋白的抗体(购买自上海近岸蛋白有限公司，货号da042)，浓度为1μg/μl；小分子对照为绿原酸标准药品，浓度为100μm。
80.将以上组分进行组装，试剂盒放入4℃保存。
81.实施例3靶点蛋白质标准热稳定曲线质控
82.对实施例1中制备的蛋白进行标准热稳定曲线质控，将10μl蛋白样品稀释液加入到各蛋白的反应孔中，终体积20μl。
83.启动程序：
84.该蛋白质芯片所有蛋白的质控图如图4、图5所示，每种蛋白在不加药物时的正常熔解曲线，其中(nfkb1)p50蛋白进行了四个蛋白浓度的摸索，根据试剂盒蛋白浓度摸索条件测试结果，本试剂盒采用nfκb1(p50)蛋白终浓度在 0.045μg/μl，本试剂盒其他蛋白选择浓度为0.09μg/μl蛋白浓度进行实验。
85.上机检测的程序如下：
86.启动程序：
87.步骤1，温度37℃，时间2分钟；
88.变温程序：
89.步骤1：1.0℃/s，37-60℃；
90.步骤2：0.5℃/s，60-90℃；
91.结束后，在仪器上读取实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，导出温度和荧光信号对应的数值，用软件绘制出曲线图，以曲线峰值对应的温度为tm 值，并用软件分析。
92.实施例4该产品用于新冠靶点小分子的药物的结合测试结果
93.针对实施例2制备的试剂盒，按照如下加样量配制反应体系：
94.向芯片的体系中加入用样品稀释液稀释的小分子药物绿原酸，终浓度10μ m，药物稀释比小于1：10；
95.上机检测的程序进行设置，如下所示：
96.启动程序：
97.步骤1，温度37℃，时间2分钟；
98.变温程序：
99.步骤1：1.0℃/s，37-60℃；
100.步骤2：0.5℃/s，60-90℃；
101.结束后，在仪器上读取实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，导出温度和荧光信号对应的数值，用软件绘制出曲线图，以曲线峰值对应的温度为tm 值，并用软件分析，计算δtm值。
102.小分子药物筛选实验如图6所示，为annexin a2与结合药物绿原酸的靶点，通过已知的药物和靶点结合的情况对该试剂盒进行阳性测试，表明该试剂盒能够在小分子药物筛选领域工作。
103.实施例5该产品用于新冠靶点大分子药物的结合测试结果
104.针对实施例2制备的试剂盒，用样品稀释液向芯片的体系中加入新冠病毒n 蛋白的抗体(购买自上海近岸蛋白有限公司，货号da042)质量2μg，具体操作步骤如下：
105.上机检测的程序如下：
106.启动程序：
107.步骤1，温度37℃，时间2分钟；
108.变温程序：
109.步骤1：1.0℃/s，37-60℃；
110.步骤2：0.5℃/s，60-90℃；
111.结束后，在仪器上读取实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线，并按照实施例4方法用软件分析，计算δtm值。
112.大分子药物筛选实验如图7所示，用已知的新冠病毒n蛋白抗体去测试大分子抗体药物对n蛋白的影响，结果n蛋白的δtm值出现明显转移。
113.实施例6该产品用于复杂中药体系的靶点筛选
114.针对实施案例2中的试剂盒，首先对中药复杂体系(此处为半夏的水提物，原药浓度1.00g/ml，药材购买自北京同仁堂股份集团)进行去大分子处理，采用3kda的超滤管4℃离心，30min，去除其中的大分子带来的干扰；按照1： 10采用样本稀释液对中药复杂体系进行稀释，具体操作步骤如下：
115.上机检测的程序如下：
116.启动程序：
117.步骤1，温度37℃，时间2分钟；
118.变温程序：
119.步骤1：1.0℃/s，37-60℃；
120.步骤2：0.5℃/s，60-90℃；
121.结束后，计算δtm值。
122.中药药物靶点筛选实验如图8所示，结果表明半夏对ace-2蛋白的δtm值出现明显转移。
123.实施例7试剂盒的准确度
124.针对实施例2中的实际盒，参照实施例5的方法，对新冠病毒n蛋白的抗体进行10次重复检测，并设置空白对照，结果表明，10次检测均出现与实施例 5相同的结果，空白对照均无结果，本试剂盒的重复率和准确率较高。
125.实施例8试剂盒的灵敏度
126.参照实施例4的实验方法，对绿原酸进行浓度梯度稀释后检测，结果表明本发明的对绿原酸的最低检测限为0.5μm，试剂盒操作所要求的10μm浓度，完全保证小分子与靶点蛋白的真实结合能够被检出。