经验分享：毕赤酵母表达系统介绍

作者：张馨予

蛋白表达是指利用细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术，是基因工程技术中的重要组成部分之一。毕赤酵母表达系统由于其低成本高产出并具有一定翻译后修饰等优点而被越来越多的使用。

一、毕赤酵母表达系统特征

酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统，甲醇酵母表达系统以及其他酵母表达系统。毕赤酵母属于甲醇营养型酵母，能够将甲醇作为唯一碳源 [1] 。那么毕赤酵母表达系统有哪些优势呢，我们总结了以下主要几点：

（ 1 ）拥有目前最强，调控机理最严格的启动子之一醇氧化酶基因 AOX1 启动子，非常利于外源基因的表达调控 [1] ；

（ 2 ）具有翻译后的蛋白加工修饰功能例如磷酸化、糖基化等，是一种不可多得的集聚多种优势的真核表达系统；

（ 3 ）既可以在细胞内表达，也可在细胞外表达 [1] ；

（ 4 ）培养基成本低廉，培养条件简单，生长繁殖速度迅速；

（ 5 ）外源基因可以单拷贝或者多拷贝的形式在特定的位点整合进酵母染色体上，伴随着染色体的复制而复制，有较高的遗传稳定性，同酿酒酵母一样以稳定的表达菌株存在 [2] ；

（ 6 ）可以进行大规模发酵，适合高密度培养，非常适合重组真核蛋白的工业放大化生产制备。

二、毕赤酵母表达系统常用菌株类型

毕赤酵母宿主菌常用的菌株类型有四种（如表 1 ），分别是X33、 GS115 、 KM71H 、 SMD116 [3] 。其中 X33 是野生型菌株，而 GS115 和 KM71H 两种，都具有 HIS4 营养缺陷标记。 GS115 菌株具有 AOX1 基因，属于 Mut+ ，指的是甲醇利用正常型； KM71 H 菌株的 AOX1 位点被 ARG4 基因插入，属于 Muts ，指甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法 [2] 。 SMD116 （ his4 pep4 ）属于蛋白酶缺失型菌株，它能够表达一些由于蛋白降解而引起的的表达产物分布不均的问题。只是由于 SMD116 （ his4 pep4 ）菌株生长缓慢，导致表达的外源蛋白质产量低。

表1毕赤酵母宿主菌常用的四种菌株[3]

三、毕赤酵母表达载体类型及特征

毕赤酵母表达载体以整合型载体为主，常见的整合型载体包括胞内蛋白表达和分泌蛋白表达两种类型。如果外源蛋白属于细胞溶质型的无糖基化蛋白，则适用于胞内表达。如果外源蛋白能够正常分泌，或者是糖基化蛋白又或者能够分泌到细胞内的细胞器中，那么可以使用分泌表达的方式 [1] 。

毕赤酵母分泌表达载体主要有： pPICZ α A （载体图谱如图 1 ）、 pPIC9K 等。使用酿酒酵母的分泌信号 — α交配因子 ( α -factor) 引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的正确分泌 [1] 。毕赤酵母胞内表达载体主要有： pPIC3K 、 pPICZA 、 pPIC3.5K 等。目前平台提供 pPICZ A 载体用于毕赤酵母胞内蛋白表达， pPICZ α A 用于分泌蛋白的表达，所有载体均利用 AOX1 启动子来诱导表达。

图1： pPICZα A, B, C载体图谱[3]

毕赤酵母表达载体包含醇氧化酶－ 1 （ AOX1 ）基因的启动子和转录终止子，它们被多克隆位点（ MCS ）分开，外源基因可以在此插入，此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（ HIS4 ）选择标记及 3'AOX1 区 [4] 。 X33和 GS115 菌株的 AOX1 区或 KM71H 菌株的 AOX1:: ARG4 区同载体 pPICZ 或 pPICZα 上的两个 AOX1 区域 AOX1 启动子区和 AOX1 转录终止区 (TT) 任一区域发生单交叉事件，都会在受体菌 AOX1 或 AOX1::ARG4 基因的上游或下游插入一个或多个载体拷贝。转化子在 X-33 或 GS115 中的表型为 Mut+ ，在 KM71H 中则为 MutS [5] 。通过在重组质粒 AOX1 的 5 'AOX1区进行线性化，可以根据使用的受体菌方便地产生 Mut+ 或 MutS 重组转化子。图 2 显示了重组质粒插入完整的 AOX1 位点 (Mut+) 的结果，以及 pAOX1 基因和 Zeocin 抗性基因的获得，这也发生在未线性化的载体和自连的载体上，但频率较低。

图2 外源基因插入AOX1或aox1::AGR4位点[3]

四、毕赤酵母表达外源蛋白的方法步骤

毕赤酵母表达外源蛋白的基本操作流程如图 3 所示，具体的操作步骤请看后面的内容。