突变率提高23万倍、可一天完成变异筛选，新型定

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

在非哺乳动物细胞中进化得到的蛋白质，常常会因错误的折叠修饰、分子间相互作用、错误的细胞定位等因素，无法在复杂的哺乳动物细胞中正常工作。因此，开发能够应用于哺乳动物细胞中的定向进化技术是一大趋势。

“我们开发的 TADR 系统应用范围更广，在大肠杆菌、酵母甚至哺乳动物细胞中都有应用潜力。” 易啸说。

易啸是中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所（以下简称为 “合成所”）研究员，博士师从明尼苏达大学分子进化学家 Antony Dean 教授学习种群遗传学和生态学，并与其导师提出了生物多样性的新理论，后期从理论转向实验研究。他在博士后期间与工程生物学结缘。

图丨合成所研究员易啸（来源：受访者提供）

今年 7 月，易啸作为第一作者和并列通讯作者在 Science Advances 上发表最新研究成果。该团队利用合成生物学的方法开发了一个 “智能” 细菌系统 —— 靶向性人工 DNA 复制体（TADR），该系统能够在活细胞内将大量突变快速靶向到指定的任意一段 DNA 序列上，而不会影响基因组的其他部分。

“TADR 系统将突变率提高了 23 万倍，一天即可完成变异筛选，快速进化基因。我们正在探索潜在应用方向，比如说用该系统进化指定的大分子或者抗体。” 易啸说。

突变率提高23万倍、可一天完成变异筛选，新型定

（来源：ScienceAdvances）

TADR 系统是易啸在博士后期间的一个合成生物学项目。在博士后研究阶段，易啸花费 5 年时间独立设计开发出了 TADR 系统，并获得了相关技术的美国专利。现在他已经在合成所材料合成生物学中心成立了合成进化实验室，该实验室的一大重点就是围绕 TADR 系统展开基础研究和探索应用场景，解决科学和生产问题。

易啸坦言，现阶段，TADR 系统是其在研究生涯过程中最有成就感的一项研究。

将突变率提高23万倍，一天即可完成变异筛选

细胞外突变法是目前最为成熟且直观的一种定向进化方法，包括易错 PCR（error-prone PCR）、易突变菌株（mutator strains of bacteria）以及可产生非随机突变的定点突变（site-directed mutagenesis）等。

然而，这种方法往往需要密集的人工操作，多数情况下只能在有限的突变库上进行一轮进化。如果想要得到更有优势的蛋白质，或者完成更复杂的定向进化目标，就需要更大体量的突变库，以及进行多轮迭代进化。

为了突破这些瓶颈，加快进化速度，更快获得更复杂的进化目标，研究人员开始尝试开发细胞内突变方式。

易啸团队开发的 TADR 系统就是一种细胞内突变方法，整个进化过程在活细胞里面完成。TADR 系统系统也叫最简 DNA 复制体，是由三个蛋白质组成的蛋白复合体，分别为噬菌体蛋白 CisA、细菌 Rep 解旋酶、T5 噬菌体 DNA 聚合酶的出错性突变子。

该系统能够在短时间内把大量突变靶向指定的 DNA 上面，同时保留基因组其他部分的完整性。

具体来说，他找到了一种噬菌体，其在天然复制过程中有一个能够特异性识别 30 碱基对序列的蛋白，识别以后，噬菌体就从该位点开始复制 DNA。所以他把出错率高的 DNA 聚合酶融合到了这个噬菌体的蛋白上，利用这个噬菌体的蛋白去把出错率高的 DNA 聚合体靶向到指定突变的 DNA 上游。

突变率提高23万倍、可一天完成变异筛选，新型定

（来源：ScienceAdvances）

易错 PCR 是一种简便快速在 DNA 序列中随机制造突变的方法，通过改变传统 PCR 反应体系中的 Mg2+ 浓度、dNTP 的浓度比例、pH 值等，使碱基在一定程度上随机引入错误而创造序列多样性文库。这种方法的关键在于控制合适的突变频率，较低的突变率能够积累大部分的有益突变，而较高的错掺率则会产生中性突变或有害突变。

“与基于出错 PCR 和体外质粒构建的传统定向进化方法相比，TADR 可以避免分子连接、细胞转化等效率极低的步骤，从而实现在活细胞内快速连续进化分子和细胞表型的潜力。” 易啸说。

该团队进一步对 TADR 系统进行了量化，研究表示，与野生型突变速率相比，TADR 的突变速率提高了约 23 万倍，即 2.3*10^5。