全面解读 | 融合基因检测：DNA or RNA? PCR or NGS?

作者：杨超月

本文通过对国内外研究数据的深入分析，全面解读DNA和RNA水平检测融合基因的生物学背景差异，融合基因检测该基于DNA水平还是RNA水平？以及首选检测技术平台是PCR还是NGS？

DNA和RNA用于融合基因检测的生物学原理
融合基因检测相关的基因序列特点

在DNA水平上，融合断点位置通常发生在较长的内含子区域，且融合的断裂点不同患者可能不同，故用传统的PCR直接扩增断裂点是不易实现的，采用NGS的方法设计探针去抓取断裂点是一种可行的检测方法，但从DNA水平检测融合基因不可避免存在如下局限性和挑战：1）融合基因检测要覆盖非常冗长且含有大量重复序列的内含子区域才能准确地找到融合断裂点；2）高GC含量不利于探针有效捕获目标区域片断；3）不同基因的内含子含有非常相似的重复序列，这一特征不利于序列准确对比，影响检测准确性；4）复杂的转录或转录后的剪接加工过程，可能会影响基因的融合。因此，不难理解的是在RNA水平检测融合基因是相对高效、精准的。

相比DNA水平，RNA水平上融合基因表现为前后两个基因外显子之间的衔接，融合点相对固定。这一特征为精准设计探针或引物提供了先天优势。因此，根据融合基因序列特点，在RNA水平上检测融合基因比DNA水平更易实现。

图1 DNA水平和RNA水平基因融合示意图

融合基因在RNA水平上“模板”急剧增多，更易检测
早在2012年Genome Res发表了一项关于肺腺癌的转录特征和突变特征的研究[1]，该研究检测了200例肺腺癌手术标本的基因改变，其中87例进行RNA测序。研究显示不管是ALK融合、ROS1融合还是RET融合，融合基因的RNA表达量都显著上调（图2）。其原因是融合基因保留了其激酶催化结构域的3’端和融合伴侣启动子的5’端，融合伴侣在自身发生转录的同时，其下游激酶区域同时发生了转录。即在生理状态下原来不应该转录的激酶区域，在形成融合基因后，其激酶区域转录被激活产生了大量的mRNA。因此，在RNA水平上检测融合基因比DNA水平更敏感。

图2 RNA测序-融合基因分子数示意图

融合基因检测：用DNA还是RNA？

纽约纪念斯隆凯特琳癌症研究中心（MSKCC）的一项真实世界肺腺癌大队列研究中（图3）[2]，DNAseq(MSK-IMPACT 468 genes DNA panel)检测的驱动基因阳性率为76.6%（1933/2522），其中融合阳性率为7.7%（195/2522）。DNAseq检测为驱动基因变异阴性的232例患者中，经RNAseq可检测到更多融合及MET 14号外显子跳跃15.5%（36/232）（图4），其中融合阳性患者为30例，将融合阳性率从7.7%（195/2522）提高到10.4%（225/2165），可见，RNAseq可挽回DNAseq漏检的融合。

图3 肺腺癌队列

图4 DNAseq和RNAseq的驱动突变

在专业权威杂志J Thorac Oncol上发表一篇文章中[3]，比较了 DNAseq 和RNAseq两种方法检测肺癌MET 14号外显子跳跃的检出率，两组数据结果显示，相较DNAseq，RNAseq更敏感（表一）。表一 MET 14号外显子跳跃检测：DNAseq vs RNAseq