一种改进的肾透明细胞癌原代细胞培养方法

作者：张馨予

肾细胞癌是肾癌最常见的类型，占85%～90%[]。为研究其发病机制和治疗，建立合理、稳定、高效的细胞原代培养模式已成必然。原代培养指直接从体内取出肿瘤细胞或组织进行的第1次的培养，应用于各类实验研究[, ]。目前常用的肾透明细胞癌原代培养法有组织块法、机械分离法、胰酶消化法和胶原酶消化分散细胞培养。但存在如下缺点：①受恶性肿瘤组织类型复杂性的影响，体外原代培养成功率较低。②通过酶消化法分离的肿瘤细胞，体外贴壁扩增本身具有细胞选择作用，得到的细胞能否代表体内真实细胞组成，值得商榷。③非肿瘤组织和坏死组织难以较好地去除，培养细胞含杂细胞较多，尤其是成纤维细胞。④对细胞量要求较高，机械研磨会损伤细胞活性，都不利于原代培养的成功。⑤现有方法容易受到培养体系的影响，特别是胎牛血清的质量和数量、培养基种类、肿瘤细胞类型等都是影响肿瘤细胞体外原代培养的主要因素。裸鼠体内传代法则需要SPF级动物实验室，操作要求较高，其他不可控因素较多。近年来国外有人采取新的原代培养方法试图获得遗传表型更接近原位肿瘤的培养细胞，如Endo等[]研发了一种肿瘤组织来源的瘤球培养(cancer tissue-originated spheroid,CTOS)法，用于125例外科切除样本和18例胸腔积液中非小细胞肺癌细胞的原代培养，即将部分消化的肿瘤块用干细胞培养基培养，获得了具有高度活性和纯度的原代肺癌细胞，其中外科组织的CTOS法成功率为80.0%。Seidel等[]在无血清培养条件下从恶性脑胶质瘤中获得肿瘤球，进行了原代培养。无血清悬浮培养法的研究结果表明：不管是来自临床样本活细胞还是肿瘤细胞系的瘤球形成细胞都具有干细胞样的属性，其增殖、分化、自我更新、细胞表型、致瘤性和放化疗抗性都很好地重塑了来源细胞的属性[]。因此，本研究探讨采用该法进行肾细胞癌原代培养的可行性，以期为肾癌研究提供理想的模型。

1 材料与方法 1.1 试剂

RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国HyClone公司；胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶、胰岛素和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自美国Sigma-Aldrich 公司；小鼠抗人上皮膜抗原(EMA)单克隆抗体、小鼠抗人CD68单抗、小鼠抗人CK8单抗、兔抗人CK18单抗、FITC-或PE-连接的小鼠抗IgG同型对照抗体均购自美国Miltenyi Biotec公司；Alexa Flour®488标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(二抗)、Alexa Flour®594标记的山羊抗小鼠IgG(二抗)均购自北京中衫金桥生物技术有限公司；碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生长因子(epithelial growth factor，EGF)购自美国PeproTech 公司。

1.2 标本来源

肾透明细胞癌组织取自兰州大学第二医院2011年9月至2012年2月行手术单侧全切或部分切除的9例患者，共取得11块肾透明细胞癌组织。

1.3 方法 1.3.1 组织块处理方法

肿瘤样本在手术切除后的1 h内进行收集，取50 mL塑料无菌带盖离心管，内装RPMI1640细胞培养液20 mL(提前在4 ℃冰箱中预冷)，培养液内含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。在无菌环境下，切取非坏死部位的肿瘤样本，体积在1 cm3以上置于所述无菌离心管内，冰上运输，迅速带回实验室。在生物安全柜内，将肿瘤样本转移至100 mm细胞培养皿(Corning，430167)内，用PBS 10 mL冲洗3次，将血细胞清洗掉，剔除表面筋膜等非肿瘤组织。将肿瘤组织转移至一新的100 mm细胞培养皿内，滴加0.5 mL PBS，用无菌手术刀片、手术剪和手术镊将肿瘤组织全部分割为直径小于1 mm的小碎块。转移至50 mL离心管，用台式离心机，500 r/min离心2 min，用移液器移除离心管内上清，再用10 mL含胶原酶Ⅱ(200 U/mL或5 mg/mL)的无血清RPMI1640培养基进行重悬，置37 ℃恒温摇床上进行振荡、消化1 h(消化时间取决于样本大小；如果样本大于1 g则消化时间增至1.5～2 h)。将消化后的肿瘤组织悬液用台式离心机500 r/min离心5 min，弃去上清液，消化的肿瘤组织用10 mL PBS重悬，过筛(100目，孔径0.16 mm)，将其收集于100 mm培养皿中。

1.3.2 肾癌细胞囊球培养

肾癌非黏附囊球培养基组成参照 Bussolati等[]的方法，即无血清RPMI1640培养基中含有10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、5 μg/mL胰岛素和0.4 g/100 mL的BSA。按本实验室方法将上述得到的细胞悬液过40 μm孔径的细胞筛并收集于50 mL离心管内，用血细胞计数板计数。然后将其1 200 r/min离心5 min，弃去上清，用无血清RPMI1640重悬，悬液的细胞数为1×103 /mL。细胞置入超低黏附细胞培养6孔板中，2 000细胞/孔，同样培养3板，置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养14 d，期间每3天添加上述的无血清RPMI1640培养基，100 μL/孔。新配制的无血清RPMI1640培养基在4 ℃下保存应不超过2周。

1.3.3 肾癌细胞传代培养