CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤（一）敲入位点的选择

作者：张馨予

简介：将外源基因引入细胞或动物体中对于生物学及药学研究至关重要。转基因的应用包含但不限于：1）过表达目的蛋白，用以检测基因表型；2）荧光标签标记目的蛋白，用以跟踪其细胞定位；3）引入野生型等位基因拯救突变型；4）在特殊的物种中表达蛋白，例如，在人体内表达小鼠源蛋白。通常情况下，这些转基因是以质粒形式瞬时表达。然而，诸多研究要求将基因整合到宿主基因组以稳定表达，传代。该文中，我们将讨论将外源基因整合到宿主基因组的优缺点，“Safe Harbor”在小鼠或人类基因整合中的应用，用于向人类 AAVS1 和小鼠 Rosa26 Safe Harbor 位点敲入外源基因的基因组编辑工具的能力。

转基因的风险

将外源基因整合到细胞中最经典的方法是转染或注射线性化 DNA，从而实现随机、非特异地整合。随机整合运用于转基因，可其存在 2 大难题：1）基因中断，表现出致死性或其他有害表型；2）整合位点呈现染色质结构，导致基因沉默。另外，细胞结构成分复杂，使得转基因自身影响的翻译也变得更加复杂。因此，一个适应于外源基因良性插入并表达的基因组位点很重要。

人与小鼠 Safe Harbor 位点

用于哺乳动物外源基因插入的基因组“安全位点”这一概念要追溯到 20 世纪 90 年代末 Philipe Soriano 及其同事（Zambrowicz, et al., 1997）。他们发现一只被命名为 ROSAβgeo26 的小鼠品系。该品系的小鼠因为一个随机插入的基因，在所有组织中都能检测到高水平的β半乳糖苷酶表达。随后的工作定点在第 6 号染色体的基因插入位点。该位点表达一个编码转录本和两个非编码的转录本，只有非编码转录本的序列受到外源插入的干扰。虽然带有外源插入片段的纯合子小鼠幼崽的出生率略低于杂合子幼崽，但纯合子幼崽也能正常发育和繁殖。因此， “Rosa26”位点可被用于基因安全敲入，该位点的基因敲入对细胞及小鼠的健康无副作用，并能保证转入基因的正常稳定表达。

后来，发现了与小鼠 Safe Harbor 位点相似的人类基因组 Safe Harbor 位点（DeKelver, et al., 2010）。这一发展显示腺相关病毒（AAV）整合到一个基因组位点：第 19 号染色体上的 PPP1R12C 位点。在该位点插入的 AAV 基因，亦叫做 AAVS1，在宿主细胞中无明显的表现型，包括原代和永生化细胞，可诱导的多功能干细胞及胚胎干细胞。作者证明了在 AAVS1 位点靶向插入外源基因对各种细胞均无副作用。另外，插入的外源基因无论在天然的PPP1R12C 还是在外源启动子的引导下，在经过多次细胞传代后都表现出持续一致的表达水平。

具体参见：《CRISPR-Cas9 Knockin Micefor Genome Editing and Cancer Modeling》张峰---转基因小鼠

《Rosa26-targeted swine models for stable gene over-expression and Cre-mediated lineage tracing》赖学良--转基因猪