环境工程微生物研究中现代分子生物学技术的运用

作者：张馨予

　　摘要：　环境污染不断加剧，物理、化学、生物及其组合工艺虽然能对污染物有一定的去除效果，但处理效果难以再次提升，因此引入分子生物学技术，从分子的角度对环境污染问题进行探究。利用分子生物学技术的手段，研究微生物种类、结构与去除率之间的关系，通过控制微生物的群落以达到最佳的处理效果。核酸杂交技术、基因芯片技术、PCR及其衍生技术、高通量测序技术等现代分子生物学技术不仅在食品、医疗领域广泛应用，在环境微生物领域中也具有不可替代的重要作用。

　　关键词：　分子生物学技术; 环境工程; 微生物;

　　随着水体污染的加重，水体中有机污染物的降解成为人们关注的热点问题。作为降解有机污染物质的主力军——微生物，其物种多样性及群落结构对生态环境均会造成一定的影响。为了更好地了解微生物的状态、确保生态环境安全、改善生态环境质量，将现代分子生物学技术引入到环境工程微生物领域中。

　　现代分子生物学技术，即通过对分子水平的线性结构进行检测，进而比较各个物种、细胞的生理状态。May等[1]构建了含有引物结合位点的合成DNA片段，用于定量分析10种不同的微生物；Zabkiewicz等[2]使用基于16S rRNA基因的序列分析的方法，确定从外生菌根和桦树根部分离的细菌种类。武志华等[3]采用PCR-DGGE技术分析内蒙古西部地区土壤细菌的多样性，为未来该地区的细菌资源开发利用及生态系统的稳定性提供基础数据。

　　现如今广泛应用的现代分子生物学技术有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、

　　荧光原位杂交技术、基因芯片、qPCR技术及高通量测序技术等[4]，这些技术在分析微生物多样性、判别微生物种类、降解有机污染物等方面发挥着重要作用。

环境工程微生物研究中现代分子生物学技术的运用

　　1 、现代分子生物学技术

　　1.1 、核酸杂交技术

　　核酸杂交技术是通过核酸分子杂交检测靶序列，进而可以定量或定性检测DNA序列片段。随着核酸杂交技术不断的完善，在此基础上，又形成了一系列衍生技术。

　　印迹杂交技术根据所分析的物质是DNA还是RNA，分为Southern印迹杂交和Northern印迹杂交，这种杂交技术多用于染色体检查等生物领域。原位杂交可以准确地对核酸序列进行定位，有利于分析微生物种类多样性。在原位杂交的基础上，用荧光进行标记，便形成了新的杂交方法——荧光原位杂交。由于荧光原位杂交具有定位准确、特异性好等优点，因此在环境微生物领域中应用的最为广泛[5]。

　　1.2 、基因芯片技术

　　基因芯片又称生物芯片，是20世纪80年代中期发展起来的，通过检测杂交信号强度，从而得出分子信息的一种技术。基因芯片的分类方式和种类多种多样，可分为原位合成、DNA微阵列[6]、无机片基等。在微生物群落和多样性的研究中，多采用系统寡核苷酸芯片、群落基因组芯片及宏基因组芯片[7]。除此之外，基因芯片还大范围地应用于食品、药物、机械、航天、农作物优选等领域。尽管基因芯片技术已经得到了良好的发展，但仍有一些目前无法解决的难题，如它的成本高、灵敏度较低、重复性差、操作复杂等，使得它很难对大量信息进行解读。这些问题通过样品的制备、探针固定、数据读取及分析等几个方面反映出来。

　　1.3、 PCR技术

　　PCR技术，又称为多聚酶链式反应，是现代分子生物学技术中的一种。这种体外DNA扩增技术不仅灵敏度高，而且反应快速。随着PCR技术的不断完善，形成了定量实时PCR(qPCR）、PCR基因测序、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-RFLP等一系列衍生技术，并在环境微生物领域发挥着重要的作用。qPCR作为检测和量化目标微生物的工具，已被广泛应用于环境微生物生态学研究中，以便于更好地理解废水中微生物群落的复杂性[8]。定量实时PCR可提供比其他分子技术更加具体、准确的定量，但在实际中应用时仍需要考虑一些必要的限制；PCR-SSCP分析技术可使构象上有差异的分子进行分离，而且这种技术的操作过程简单、反应快速、灵敏，毋需其他特殊的仪器；PCR-DGGE则是将序列不一样的DNA分开；PCR-RFLP技术，即通过特异性内切酶消化切割成不同长度的DNA片段条带。这种技术操作方法简单、DNA的含量也得到了很大的提高。Shannon等[9]采用实时定量PCR(qPCR）检测城市污水处理的五个阶段。实验结果发现，这种qPCR方法可有效地检测废水中的病原体。

　　1.4 、高通量测序技术