《临床生物化学》在线阅读

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

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一、核酸杂交技术

检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努力克服。

杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因（被检基因）应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般32P标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml，原位杂交无论放射还是非放射物标记，一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时，杂交速率取决于探针长度，如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交，10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩尔浓度已足以达到需要的检测灵敏度。为了促进长探针（＞250个核苷酸）的杂交速率，加入杂交促进剂是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用浓度为5％-10％，浓度过高会增加杂交液粘度。聚乙二醇也作为促进剂，价廉且粘度低，但检测本底太高。另外杂交的温度、盐浓度、甲酰胺浓度可调节杂交分子形成的稳定性。理论选用DNA：DNA杂交温度T＝Tm－25℃，此时杂交分子最易形成。但具体实验中影响Tm值的因素很多，一般杂交温度低，形成的杂交分子较稳定。RNA：DNA杂交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA杂交分子的Tm大20-25℃，使得杂交温度提高，此时需调节甲酰胺浓度来调节杂交温度。好的实验条件最终应在实践中摸索建立。

（一）斑点杂交

将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯膜（PVDF）与DNA结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用真空点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探针分析DNA为例，结果是显色。

取硝酸纤维素膜和滤纸在2xSSC(NaCl 300mmol/L，柠檬酸钠30mmol/L)，pH7.0浸15分钟，平铺滤纸在点样抽滤器上，再铺上硝酸纤维滤膜，真空抽气使点样器减压，膜显出凹面。点样50μl（5-10μgDNA，可直接点血清样品）于凹面，撤去真空，把膜晾干。取滤纸浸0.5mol/l NaOH，1.0mol/l NaCl，把膜平铺于滤纸上20分钟，变性。取滤纸二张分别浸在0.5mol/l Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/l Tris-HCl，0.6mol/l NaCl pH7.5，分别依次把膜平铺于滤纸上，各中和15分钟，中和后膜的pH为7.2-7.5。于80℃，30-45分钟烘干。（RNA分析点样缓冲液系统不同，无需变性，中和，余大致相同）用塑料封口机把膜和2.5ml预杂交缓冲液封入塑料袋中，42℃，水浴30分钟。

预杂交缓冲液： 65℃6xSSC （原液：20xSSPE）
5xDenhardt （50xDenhardt）
0.5％SDS （10％SDS）
100μg/ml变性鲑精DNA片段（1mg/ml）
42℃增加50％甲酰胺（原液），配成20ml.

50xDenhardt：5g聚蔗糖（Ficoll，400型，Parmacia），5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组份Ⅴ，Sigma）加水至500ml。过滤后－20℃保存。

探针2ml（50-100ng/2ml预杂交缓冲液）于100℃，10分钟，马上置冰浴5分钟（变性）。加入袋封口。42℃水浴过夜。去杂交液（可回收）。以2xSSC，0.1％SDS15ml，50℃5分钟洗二次。0.1SSC，0.1％SDS洗二次。封闭：另取袋封入膜和封闭液（蛋白质50mg/ml，100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)/150mmol/LNaCl）2.5ml，37℃，30分钟。去封闭液（可回收）。100mmol/lTris-HCl(pH7.5)/150mmol/L NaCl ，15ml，5分钟洗二次。亲和反应：酶标抗体3ml（酶有碱性磷酸酶、过氧化物酶等，标记物有抗地高辛、生物素等，现以地高辛标碱性磷酸酶为例4μg/3ml 100mmol/L Tris-HCl，150mmol/l MgCl2，10mg/ml牛血清白蛋白），封入袋中37℃，30分钟。100mmol/l Tris-Hcl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl2，pH9.5，10ml，1分钟洗一次。取硝基四氮唑兰（NBT）75mg/ml 70％二甲基甲酰胺25μl，4-溴-5-氯-3-吲哚磷酸50mg/ml二甲基甲酰胺20μl（底物）和100mmol/l Tris-HCl，100mmol/l NaCl，50mmol/l MgCl2，pH9.56ml混匀，37℃，避光反应三小时，显色。蒸馏水洗膜，晾干。观察结果。

（二）Southern blot