稳定氮同位素示踪技术在烟草研究中的应用

作者：杨超月

　　摘　要　　稳定氮同位素示踪技术作为科学研究的一种手段在农业科学的各个领域已被广泛的应用，在烟草研究中的应用有着悠久的历史。本文综述了稳定氮同位素示踪技术在烟草氮素营养吸收利用，烟草肥料吸收、利用及土壤残留，烟草生物碱合成与代谢等方面的应用，并指出了目前研究中存在的问题，对今后稳定氮同位素示踪技术在烟草研究中的应用提出展望。

　　applications of stable nitrogen isotope methods in tobacco studies

　　abstract：as a method，stable nitrogen isotope technology has been used in agricultural research widely，and it also has a long history in tobacco studies.this article summarized the applications of stable nitrogen isotope methods in tobacco nitrogen absorption and utilization，tobacco fertilizer absorption、utilization and leftover in soil，tobacco alkaloid biogenesis and metabolism. and puts forward existing problems in the present studies and developing propects of applications of stable nitrogen isotope methods in tobacco in the future.

　　keywords：stable nitrogen isotope；tobacco；15n；application

稳定同位素是进行农业科学研究的一种十分直观、灵活和方便的手段。在烟草研究中利用稳定性同位素示踪技术的历史可以追溯到上世纪40年代，在稳定性同位素示踪技术刚出现不久，美国人vickery h.b.[1]等就利用15n研究了烟草氮素的吸收。在随后的时间里，稳定氮同位素示踪技术被广泛的应用在烟草体内物质代谢、生物碱合成与代谢、营养物质的转运与分配、烟草肥料利用率的测定及植烟土壤有效养分的测定等领域，并取得了巨大的成绩，加深了人类对烟草这种特殊经济作物的认识，并为人类科学种植烟草、人工改造烟草提供了帮助。

　　1在烟草氮素营养研究中的应用

　　1.1氮素的吸收、运输、储存及代谢

　　氮是影响烟株生长和发育以及烟叶质量的最重要的元素[2][3]。施氮率比施肥土壤的总量更多地影响烟草产量和化学组成，氮素在土壤中移动性很强，被植株吸收和转移也很快[4]利用15n标记证明，从根部吸收的n在72小时之内即被结合到叶内的蛋白质中[1].yoshida也证实[5]，不论15n从叶还是从根部进入植株，2～3天内都均匀地分布于植物体内物质中。volk r.等（1954年）[6]研究发现：根外施n被烟株吸收以后，在体内移动很快，15n标记试验证明，叶面喷施尿素，可以通过表皮，角质层，毛孔及其他天然裂缝进入叶片，6小时即送到烟株所有器官[6]。

　　氮素的吸收和同化主要来自于根部，而从叶吸收的氮素量很少，当对烟叶喷施15n尿素时，所施15mg氮中的只有5mg能被叶片吸收[7].24小时后，所吸收氮素的一半从喷施的叶片转移到邻近的叶片，主脉和根中。通过叶表面的上部和下部所吸收的尿素接近一致。不考虑叶片的面积，除最顶端叶外，吸收随着叶位的升高而降低。如果叶片部位一样，叶片成熟度的影响很小。夜间喷施，被吸收的尿素的量是在白天喷施的5～10倍。vickey h. b.等[1]（1940年）研究发现，当含有15n的氯化铵施用到迅速生长的植株时，可以在植株所有器官中立刻检测到同位素的存在。吸收的nh4+很快被同化成酰胺和氨基酸，而进入蛋白质。氮中同位素的浓度表明，根中同化强度最大，而叶中最小，另一方面，叶中稳定性同位素含量最大，这说明氮素的积累在叶部最高。

　　氮在烟株体内不断转移。一般来说，从基部到顶部叶，从全氮、蛋白态氮、烟碱氮的相对含量看，均呈现上部叶>中部叶>下部叶的规律，烟株各部位总氮含量以叶片>茎>根>顶杈[8]，烟草氮的积累量：中部叶>上部叶>下部叶[9] [10].标记的氮总是从施用部位首先移动到生长器官，随后便均匀地分布于整个植株。有相当可观的标记氮仍转移到老的叶片中，即使衰老叶片实际上表明有氮的净损失。在这种衰老叶片氮可以快速结合到蛋白质中。一般认为，在烟株所有活器官中，包括老叶和黄色叶片，都有氮素不断流入，流出和转变[11。

　　1.2烟草对不同形态氮素的吸收与利用情况

　　烟草主要吸收硝态氮、铵态氮两种形态的氮素，尿素态氮和小分子的有机氮也可以被直接吸收[12]。很多研究都证明在同等条件下硝态氮比铵态氮更易为烟株所利用，但walch-liu等（2000年）[13]利用15n研究不同形态n素在烟草叶片形态建成时却发现当nh4+和no3-都以2.5mm同时处理烟草时，并不抑制烟草叶片发育。15n吸收的研究表明对烟草供应no3-或nh4no3，二者具有相同的总n净吸收率。混合形态的n素供应结果表明，nh4+和no3-的净吸收比率是6：4，很明显，在比率为1：1的情况下，烟草吸收氮素时并不完全区分硝态氮或铵态氮。

　　烟草吸收的硝酸盐被植株吸收后，在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，硝酸盐先被还原成亚硝酸盐然后被还原成氨。在这一过程中，光照对根部硝酸盐的还原影响不大，但会极大的叶部硝酸盐的还原效率[12]。andrew j. reed等（1983年）[14]研究硝酸盐和亚硝酸盐在光暗条件下在植物叶部的同化情况时，利用15n标记的硝酸盐和亚硝酸盐作示踪剂研究烟草时发现：在黑暗有氧条件下，烟草硝酸盐的同化率是白天的9%~16%；亚硝酸盐的同化率是白天的7%.在烟草内部含氮化合物的合成中，铵是烟草最后优先吸收的氮素形态，铵在烟草内部的一些生化反应过程中也会产生，比如：光呼吸，含氮分子运输和储存中的水解以及氨基酸的转化等[15]，在开始衰老的叶中，蛋白质水解也产生大量的铵分子[16]，在这些过程中产生的过量铵被从新结合进含氮分子中进入烟草内部氮循环，从而可能对烟草的组织和器官产生毒害作用。ce\'linemasclaux-daubresse（2006年）[17]利用15n标记的铵盐和15n -glu作为示踪剂研究glu的代谢和氨基酸的分解时发现：15n的标记的铵盐的同化是通过glu合成酶与glu合酶共同作用的，无论白天还是黑夜，这一过程都不依赖glu脱氢酶的作用。15n-铵盐和铵盐积累模式证明gdh在15n -glu的去氨基化过程中提供2-oxoglutarate和15n-铵盐。在黑暗中15n-铵盐合成天门冬铵酰作为额外的解除铵过量毒害的分子，在韧皮部伤流中glu的含量水平表明glu在不同的叶龄的叶中都不断的合成。damianos s. skopelitis等（2006年）[18]在利用15n　cglu、15n-gln、和15n -pro研究外部非生命胁迫对烟草蛋白质代谢的影响时发现：在外界胁迫下植物体内会产生ros、细胞内会产生铵盐毒害，而ros能够参与gdh的表达与蛋白酶的激活信号的传导，gdh和蛋白酶对于消除细胞内的铵盐毒害有帮助，gdh作为反胁迫酶能够解除铵的过量所引起的毒害，并诱导从个glu转化为pro。

　　大量的研究认为尿素不是烟草的理想肥料，它不仅降低氮的吸收，而且扰乱蛋白质的代谢，使天门冬酰胺显著积累[12].tomoyuki yamaya and philip filner（1981）[19]在研究15n标记尿素对栽培烟草的细胞的影响时发现：aha虽然增加了细胞内尿素酶的含量，但它却抑制了15n标记尿素中的氮进入细胞中的凯氏氮，因此增加栽培烟草细胞中脲酶的含量可以使烟草缓慢获得对乙酸羟基氨基的抗性。

　　外界co2的压强也影响烟草对氮素的吸收。joèrg kruse，ilka hetzger，（2002年）[20]在研究提高pco2对野生烟草和栽培烟草的影响时，利用被15n标记的单独氮源（no3-）的水溶液经过2周的培养，硝态氮的吸收在白天和夜间的测量，在环境pco2下，野生种的硝态氮吸收速率为15μmoln g-1 fw h-1，野生种在提高pco2下硝态n吸收速率并不明显降低，在白天栽培烟草的硝态氮的吸收速率在环境pco2下比野生烟草增加20%，在环境pco2下从光下到黑暗的转变明显降低了硝态氮的吸收速率。而野生烟草硝态氮的吸收速率在白天只降低10%，与pco2无关。

　　氮是氨基酸与生物碱等含氮化合物的组成部分，参与组成蛋白质、酶、叶绿素、磷脂等。氮素除直接参与细胞组成外，还影响烟草的光合作用和对其他养分的吸收[12]。thomas w. rufty等（1990年）[21]利用15n-no3-研究磷胁迫对烤烟硝态氮同化作用的影响时发现：根系中no3-运输途径的改变是在磷胁迫环境下烟草限制幼叶蛋白合成的首要反应，氨基酸含量的提高明显同蛋白质的降解联系在一起，而不是被当时蛋白质的合成所抑制。

　　2在肥料利用率及植烟土壤中的应用

　　2.1烟草对普通肥料的吸收与利用情况

　　烤烟全生育期吸收的氮素主要来自于土壤可利用性氮，随着氮肥用量的增加，烤烟对肥料氮的吸收量增加，对土壤氮的吸收量减少，土壤对肥料氮素的固定和氮肥损失量增加，an值有随氮素用量的增加而逐渐减小的趋势[22]。

　　烤烟对氮素的吸收在刚移栽3周内，速率很低，在移栽3～8周，吸氮量急剧增加，这一时期吸收了大约80%的氮[23]，在移栽后40天左右对氮素的吸收达最大值，然后又开始急剧下降，大约在移栽后70天左右，吸收速率的下降速率减慢，宋少堂等（1993年）[24]由15n示踪表明，烟草在现蕾期吸收氮量最高，团棵期最低。在烤烟吸收的氮素来源上韩锦峰等（1989年）[25]盆栽试验得出：烟草吸收的氮素59.8%~90.89%来源于土壤的速效氮肥；9.11%~40.2%来源于当季所施肥料中的氮。侯雪坤等（1994年）[26]研究表明：烤烟生育前期（30 d）以吸收肥料氮为主；中期（60 d）吸收的肥料氮与土壤氮近乎相等；后期（105d）以吸收土壤氮为主，土壤an值呈递增变化。

　　烤烟对肥料的利用率不高，用同位素示踪方法研究表明：硝酸铵施入土壤后氮素利用率低，为17%~26%，土壤保持（吸附）为24%~36%，而损失（流失）率大于40%，最高可达63%[10 ].烟草对氯化铵中氮素的利用率为30. 31%，烟草吸自肥料的氮素占全株总氮量的16%，绝大部分氮吸自土壤[27]，硝酸铵施于烟草土壤中后约24-29%被植株吸收，38-40%渗漏逸失，32-35%残存于土壤中[28].而裘宗海（1990）[29]的报导指出，移栽20天烟株来自肥料氮的百分数为50. 70-70. 68%，收获期降至27. 12-59. 75%，氮肥利用率为38. 75-43. 45%.程岩等（1992）[30]在不同土壤上的肥料试验表明，不同土壤肥料利用率不同。氮素在土壤中的损失约占一半以上，而土壤残留不超过1/5。

　　烟草对氮素的吸收利用不仅与土壤中的速效氮含量有关，同时与氮肥种类、海拔高度、土壤质地、温度的高低密切相关[24]。从不同氮素用量对烤烟的产量、质量影响分析，高海拔地区低等肥力土壤宜酌量多施氮肥；中、低海拔地区宜酌量少施氮肥[10].魏成熙等（1995年）[9]的研究表明：无论全氮含量还是含氮化合物，它们与其中肥料氮组成比例间的关系都有一致的表现；不同的施氮量对烟叶中主要化学成分及其之间的比例有显著的影响，高海拔地区下等肥力土壤宜适当多施氮肥，中、低海拔地区，中等肥力以上土壤可适当少施氮肥。土壤全氮含量、碱解氮含量与“a”值间呈显著相关；随海拨的升高，土壤供氮量占全氮、碱解氮的比率显著减少[31]。

　　2.2施肥方式对烟草肥料吸收利用的影响

　　不同的氮肥施用方式对肥料利用率，烤烟产量，质量的影响均较大。常见的施肥方式包括撒施，穴施，单条深施和双条深施（包括栽前双条施和栽后10天双条施），在我国，双条施肥基本没有被采用，而在美国，双条施肥烟田比例占总面积的75%左右[12]，mckouwm和sutton（1997年）[32]在采用15n标记肥料研究不同施肥时间和施肥方式对白肋烟的影响时发现：等量的氮肥在移栽后5周条施要比在移栽前撒施多提供大约6%～17%的氮素。

　　不同施肥方法的氮肥利用率、烟叶中总氮含量以肥料1/3基施2/3追施处理较高，2/3基施1/3追施处理居中，全部条施处理较低。氮肥利用率以栽后100天左右较高。通过15n的原子百分超的测定结果得到烟株全氮中来源于吸收肥料氮的比例在不同部位的分布是随着叶位的升高而降低，来源于土壤氮的比例随着叶位的升高而增加。不同施肥方法的肥料氮比例以肥料1/3基施2/3追施处理较高，2/3基施1/3追施处理居中，全部条施处理较低[8]。

　　稳定性同位素示踪技术在新型肥料的研制中也有应用，新型肥料不仅能提高烤烟产质量还能提高氮素的利用率。刘义新等（2002年）[33]研究结果表明：尿素改性后比改性前烟叶增产25.16%，达1%显著水准。烟株全氮量，改性后是改性前处理的145.7%.从肥料中吸收的n量，改性后是改性前处理的127.9%.从土壤中吸收的氮量，改性后是改性前处理的158.3%.n肥利用率，改性后处理为45.8%，比改性前处理提高10.1个百分点。氮的回收率，改性后处理达98.3%，比改性前处理提高12.8个百分点。改性尿素省肥增产的主要原因是刺激作物从土壤氮库中吸收了较多氮素，同时所施氮肥的利用率有明显提高。

　　2.3稳定性同位素在有机肥中的应用

　　相对无机肥料而言，有机肥肥效释放较慢，因此可以在整个生育期供给烟株生长，在我国的烤烟种植中，烟农常有施用有机肥的习惯，施用的有机肥种类包括：饼肥和厩肥。美国及我国部分学者认为，有机氮的缓效性不利于烤烟的早期生长，而又会导致烤烟的成熟和落黄不好，最终影响烤烟品质。但我国烤烟种植实践证明，施用一定数量的有机肥，尤其施饼肥，有利于烤烟的生长发育，有利于烤烟的香吃味改善[12].饼肥和无机肥各半处理的烤烟，长势，根系活力，净光合作用强度，atp含量，烟叶产量，上等烟比例等均比纯施无机化肥要高，内在化学成分也更加协调[34].封幸兵等（2005年）[35][36]等的研究表明：烤烟对饼肥和秸秆肥中15n素的吸收基本符合“s”型曲线，以25%饼肥+75%硝酸铵和25%秸秆肥+75%硝酸铵全部作基肥的处理，烟株对肥料中氮素的吸收利用率较高，分别达到94.31%和59.58%；烤烟根系从饼肥和秸秆肥中吸收的氮素首先供应营养器官中生长最旺盛的部位－顶，然后是上部叶和下部叶，茎中的氮素供应较少，根中最少；烟株从饼肥和秸秆肥中吸收的氮素在烟株各器官中的分布为：顶>上部叶>中部叶>下部叶>茎>根，且以25%饼肥+75%硝酸铵和25%秸秆肥+75%硝酸铵全部作基肥处理的烟叶氮含量较适宜；秸秆肥处理的回收率较饼肥处理的普遍要高，都在90 %左右，土壤残留率高，不利于前期烟草的生长。饼肥处理中以25 %饼肥+ 75 %硝铵全基施的回收率较高，达到81. 80 %；土壤“an”值以25 %饼肥+ 75 %硝铵基追各半和25 %秸秆肥+ 75 %硝铵基追各半最高，说明土壤有机肥施用量不宜偏高，一般以保持中等施肥水平较好。

　　3烟草生物碱研究中的应用

　　3.1生物碱的合成部位

　　生物碱是存在于动植物体内含有氮杂环的碱性有机化合物，烟草是富含生物碱的植物，烟草中有多种生物碱，栽培烟草属于烟碱积累型，烟碱占总生物碱的比例一般在92%以上[37]。

　　烟碱是在烟草的根部形成的，通过木质部输送到地上部，去甲基烟碱是在植物地上部分中烟碱脱去甲基的产物；假木贼碱在根部和地上部均能形成[38][39][40].然而，在烟草植物的其他场所也有形成生物碱的证据。用红花烟robinson和番茄rutgers品种作嫁接试验发现[41]：在嫁接植物生长液中以15n -kno3供应同位素，由烟苗嫁接在番茄根上的植株中，根部测不出有生物碱，但在苗的烟碱成分中发现有6.50原子百分超的剩留15n，去甲基烟碱中有6.22%.这些数据指出烟碱和去甲基烟碱可以在没有烟根的情况下在试验植株苗中生成。另一方面，番茄幼苗嫁接于烟草根部时，根和苗两者都发现含有大量残留15n的生物碱，而去甲基烟碱中剩留15n的原子百分超远高于烟碱中所含，尤以根部为甚。这些数据表明去甲基烟碱能在根部生成而不都是从烟碱途径形成的[42]，同时也说明去甲基烟碱可能时烟碱的前体物。

　　3.2生物碱的生理效应

　　植物细胞中存在着高含量的生物碱，它对动物有毒性但对烟叶却没有相同的作用[43]，研究认为植物中存在生物碱的原因或作用如下：

　　○1生物碱作为抵抗昆虫和食草动物的保护物。ian t boldwin（1994）[44]利用15n -kno3研究氮素胁迫和伤害诱导对烤烟中烟碱合成的影响时发现：伤害烟株较未受伤烟株在受伤后烟碱合成量增大，合成速率明显增加。

　　○2生物碱作为代谢的产物积极的参加到烟草的生命活动中。有许多试验证明烟碱不是代谢废料[45][46]：向黄花烟草和n.glauca整株植物供给15n标记的去甲基烟碱、假木贼碱和烟碱，并考察其所供给不同于宿主植株主要生物碱的标记生物碱的变化。对黄花烟草供给假木贼碱或去甲基烟碱，所回收的生物碱中15n的大部分是烟碱。但向n.glauca供给烟碱时，被回收的大部分是从它的去甲基产物形式的去甲基烟碱。回收的生物碱经过氧化，发现在所有的情况下，附加于吡啶环上和附加于吡咯烷或哌啶环上的15n几乎相等。由于从生物碱上回收的15n比其他部分多，看来似乎生物碱之间的直接转换较多，而不是所供给的生物碱的总体分解而再从代谢贮存总库组成新的化合物。有相当多的所供给的15n是以植物碱形式回收的而不是以加入的或植物中其他化合物回收的，显示生物碱并不是不活泼的或者是代谢废物。为了观察生物碱在植物代谢中的作用，将14c―15n双重标记的烟碱供应给黄花烟brasilia品种，在原有的15n中有91.6%的剩留的15n被回收，大部分在不溶性的残留物中，其余则分布于蛋白质，生物碱，游离氨基酸和色素中。这些结果肯定了生物碱不是废料的事实，他们积极参加了植物的代谢。

　　3.3生物碱代谢的途径和产物

　　烟碱是一种不安定的代谢产物，它的半衰期小于24小时[40].将15n标记的烟碱注入不同发育阶段的烟草体内，两周后在幼小的植株内发现有80%以上的标记烟碱被降解，而成熟烟株中只有50%被降解，且在烟株顶端仅降解20%.烟碱能由叶片转移到烟株其他部位，并用于代谢，烟草发育的早期阶段烟碱含量较低，这与幼小植株体内烟碱降解率有关，在叶片成熟过程中烟碱的降解率为27%～52%[5].tso和jeffrey（1961）[45]用15n标记的烟碱饲喂普通烟草，发现大部分同位素存在于游离的氨基酸和水解后的氨基酸内，证明了烟草体内的烟碱也与初生代谢途有密切的联系。采用同位素标记的生物碱饲喂证明了生物碱之间可以通过代谢发生广泛的转化作用。用15n标记的假木贼碱、降烟碱和14c―15n双重标记的烟碱对黄花烟草，粉蓝烟草和黏毛烟草进行饲喂，结果表明所有的生物碱都发生相互转化作用[41]。

　　3.4打顶措施对烟碱的影响

　　烟碱在叶中的积累主要发生在烟草生育后期，尤其时打顶以后[47][48]，打顶后烟株体内烟碱含量急剧增加，用于合成烟碱的氮超过50%来源于土壤，烟碱的合成高峰要迟于氮素吸收高峰，烟草植株能用打顶前吸收的氮素合成烟碱，打顶后供给15n标记的氮表明烟草植株中任何部分存在的氮，无论何时吸收都可以用来合成烟碱。x.y.xi等（2005年）[49]利用15n标记的nh4no3研究打顶后烟碱积累时发现：打顶后供应nh4no3延缓了叶片衰老，形成更多的烟杈，15n在总氮中的比例，15n -烟碱在总烟碱中的比例均增大，从脚叶到顶叶，15n和15n -烟碱的量都增加，当增加nh4no3的供应时，叶中烟碱含量，及15n -烟碱量都继续增加，表明在烟株生育末期（打顶后）增加氮素供应，增加了烟株总氮含量，使烟碱重新合成，导致了烟碱的集中。

　　4问题与展望

　　同位素技术在发展生物学中曾做出重大贡献，生物技术中的一些基本技术如：分子探针，核酸的标记及其序列分析是根据同位素示踪原理建立的。生物技术中的基因工程、细胞工程等研究中，同位素示踪技术是必不可少的研究手段，这些研究开辟了示踪技术应用的新领域，同时也丰富了烟草研究的内容、方法和手段。

　　同时稳定性同位素示踪技术也存在着许多不足，制约了它在科学研究中的应用：○1与放射性同位素示踪技术相比，它不能清楚的从视觉角度去追踪物质的存在，只能以量化的方式来追踪示踪物质；○2用于试验的标记肥料价格昂贵，是普通肥料价格的上万倍，这一点限制了稳定性同位素示踪技术的广泛使用。

　　今后稳定氮同位素示踪技术在烟草中的应用还应加强以下几方面的研究：

　　（1）确定合适的示踪剂引入方法在烟草生物碱的研究中如何引入示踪剂存在争议，目前引入15n示踪剂主要有两种方法：一种是叶片涂抹示踪剂[5]，另一种能够则是将高丰度的示踪剂直接注入水培烟草的培养液中[44]，两种试验方法的不同必然导致结果的差异；

　　（2）进一步深化烟草研究水平目前我国利用稳定氮同位素示踪主要局限于氮素的吸收、转化和分配状况研究，而国外则在细胞及分子标记方面应用广泛；

　　（3）拓宽在烟草中的研究领域稳定氮同位素示踪技术还可以在烟草调制、烘烤，烟草植保，烟草特有致香物质可以利用同位素示踪技术来研究在生育及烘烤过程中某些含氮物质的形成和变化规律，烟草害虫的发生及危害，通过标记烟草病毒来研究烟草病害的形成、传播及发展等；

　　（4）与其他探究手段的结合稳定性同位素技术只是我们进行科学研究的一种手段、方法，它与分子、遗传和模型的方法结合，将会加深对烟草各方面的了解和认识。

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