IP的详细操作步骤及实验组设计

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

flag和myc的标签是表达质粒中带的。把目的蛋白DNA序列克隆到带有标签序列的载体再转染到细胞中表达获得带标签的目的蛋白。你可以了解一下pcDNA3.1之类的载体就能大概明白了。这样做的ip是外源ip。与之对应的还有内源ip。

下面coip相应的实验步骤是从网友发表的帖子里粘过来的，祝你一次成功。

实验流程为：
　　（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；
　　（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
　　（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
　　（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；
　　（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
　　（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
　　注意的问题：
　　（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
　　（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用
　　（3）使用对照抗体：