第三节 DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

第三节　DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用

　　一、DNA探针的应用

　　虽然一般认为DNA探针敏感度不如cRNA探针，但在病毒的检测等领域中DNA探针仍得到广泛的应用。

　　在原位杂交细胞化学的操作步骤方面与cRNA探针基本相同，所不同的是：（1）杂交时需先在高温80～95℃短时处理，使DNA探针及细胞内靶DNA变性，解离成单链，迅置于冰上冷却。然后置于37℃～42℃杂交过夜。（2）RNA酶的溶液的冲洗不能减低背景，因此，在操作步骤中省略此步。

　　（一）地高辛-碱性磷酸酶（Dig -AKP）标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用

　　1．组织前处理

　　（1）固定：组织以10%中性福尔马林液或Bouins液固定，常规石蜡包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附剂的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更紧贴玻片。

　　（2）脱蜡：二甲苯10min ×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/l MgCl2,pH7.3～7.4）10min×2。入0.2n HCl 20min以进一步去除蛋白。

　　（3）50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。

　　（4）蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，）37℃20～25min。

　　（5）0.2mol/l 甘氨酸液：室温10min，中止蛋白酶反应。

　　（6）4%多聚甲醛（PBS新鲜配制）：室温20min。

　　（7）PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。

　　（8）脱水，自低浓度到高浓度，无水乙醇各3min，空气干燥。

　　2．预杂交封闭非特异性杂交位点，20μl/每张切片，42℃水浴半小时。

　　3．杂交10～20μl/每张切片，加盖硅化盖玻片，将切片置于95℃min，使探针及病毒DNA变性，然后迅速置于冰上1min（也有报告用乙醇使之冷却的），然后将切片置于盛有2×SSC湿盒内，42℃过夜（16～18h）。

　　4．杂交后漂洗

　　（1）2×SSC液内振动移除盖片。

　　（2）2×SSc 55℃10min×2。

　　（3）0.5×SSc 55℃5min×2。

　　（4）缓冲液II（含0.5%封阻试剂，用缓冲液I溶解）37℃30min。

　　（5）缓冲液I（10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5）15min，室温。

　　（6）酶标地高辛抗体（1：5000，应用缓冲液I稀释）37℃30min。

　　（7）缓冲液i 15min×2室温。

　　（8）缓冲液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5）室温2min。

　　5．显色

　　（1）显色液配制：缓冲液III：1ml中加入4.5μl四氮唑蓝（NBT），3.5μl X-磷酸盐（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸盐（BCIP配成））。30μl/每张切片，置暗处显色30min到2h。定时抽查切片，镜检其显色情况。

　　（2）缓冲IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0）10min终止反应，甲绿复染5min，二甲苯透明，DPX封固，镜检。

　　（二）荧光标记DNA探针的应用

　　1．概述在原位杂交细胞化学中荧光标记DNA探针（Fluorescence in situ DNA hybridisa－tion , FISH）的应用在细胞培养和染色体铺片（见二十一章　）中较为广泛。FISH属于非放射性标记，其优点在于简便，快速，其敏感性可与放射性同位素标记核酸探针相等。不少实验室报告应用FISH（2～5kbp探针）可成功地达到单个拷贝（copy）的特异性定位。

　　2．荧光标记DNA探针应用于ISHH中的基本原则（Barbara Traok和Dan Pinkel 1990）

　　（1）首先应使组织或染色体中靶核苷酸高温加热变性解离为单链DNA，化学性标记的DNA探针除外。

　　（2）杂交：一般在37℃进行，探针稀释浓度在2ng/μl，染色体铺片探针浓度在0.4ng/μl,杂交液2～3μl/每cm2盖片，每张盖片大约1.8cm2，约需10μl杂交液。有实验室报告，如每张盖片（温度为室温）加入杂交液将会降低杂交温度所需要的37℃，因此，建议对盖片应用前在37℃进行预热。

　　（3）用免疫细胞化学或组织化学方法显示荧光标记。自80年代以来，荧光素标记检测系统日益增加。包括：①生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素（avidin）或抗生物素抗体。②氨乙酰基荧光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探针（modified probe），与抗AAF抗血清。③磺酸（sulfonatc）改良探针，以抗磺酸抗血清检测（Organic Ltd, Yavene, Israel和TMc Bioproducts Rockland ME可提供此药盒）。④汞标记探针（mercurated probe），以硫氢基（sulf hydryl）与荧光标记物或-半抗原相结合，再以抗半抗原抗血清检测。⑤地高辛标记探针，以地高辛抗血清检测（Boehringer – Manubeim Inc, Mannhein, FRG可提供此药盒）。在上述各例中，为简便可采用直接法（图20-4A），为提高敏感度可采用间接法（图20-4B）。

图20-4　生物素标记核酸探针荧光免疫反应图解