激光共聚焦显微术

作者：张馨予

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope, 简称LSCM) 与传统显微镜相比，具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点，在细胞水平上可做多种功能测量和分析，能得到真正具有三维清晰度的原色图像，同时激光扫描共聚焦显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏。随着软件开发和应用技术的不断完善，激光扫描共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。下面以LSM510 激光扫描共聚焦显微镜为例对其应用做一简单介绍。

1 LSCM 的基本组成及原理

激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集和分析的精密仪器。其主要由激光光源(氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm，氦氖绿激光器：543nm，氦氖红激光器：633nm，半导体激光器：405nm)、显微镜光学系统、扫描装置(检测针孔光栅、分光镜、发射荧光分色器等) 、检测器(高灵敏度的光电倍增管(PMT)，电压越高，则光信号转换成的电信号越强，可将荧光图像的强度按照0~255 分级显示)、计算机控制系统等组成(见图1)。

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰；激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡，由探测针孔后的光电倍增管逐点接受，在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。所以照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，也就是说照明针孔与探测针孔具有共同的焦平面。在载物台上加一个微量步进马达，使载物台沿垂直方向(Z 轴) 上下步进移动，将样品新的一个层面移到焦平面上，这个层面又成像在显示器上，随着Z 轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光学图像，实现“光学切片” 的目的, 被形象地称为“显微CT”, 在此基础上计算机系统自动进行三维重建。

2 基本功能

(1) 多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集;(2) 无损伤连续光学切片图像的采集— 显微“CT”;(3) 三维图像重建;(4) 时间序列扫描： XYt 、XYZt 和 Xt 扫描，通常指共聚显微镜系统沿着时间轴对活体细胞和活体组织内被标记物变化的动态跟踪。如测细胞内Ca2+、K+、Na+ 等离子浓度的变化;(5) 感兴趣区域的扫描;(6) 定位、定量测定;(7) 图像处理。

3 荧光探针的选择

3.1 选择荧光探针的主要步骤

(1) 根据实验目的确定需要检测的目标。(2)确定可供选择的荧光探针的范围。(3)考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求，主要从以下几个方面考虑：荧光探针的特异性和毒性;荧光的稳定性;荧光的光谱特性;样品中多重荧光之间的相互影响：光谱交叉。(4)荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。
3.2 细胞内游离钙离子
常用的有Fluo-3、Fluo-4、Fura-2、Indo-1，最常用的是Fluo-4，能用可见激光(488nm)激发，发射峰为525nm，其乙酰羟甲基酯(AM)形式是 Fluo-4AM，无荧光，为不带电荷的亲脂化合物，易于渗透脂膜进入活细胞，在胞内被非特异酯酶水解，释放出游离酸形式的荧光探针分子，此游离态也无荧光，不易漏出胞外，一旦与Ca2+ 结合后便形成复合物并有较强的荧光。
3.3 DNA 和RNA 检测
主要有吖啶橙AO、碘化丙啶PI，既可标记 DNA 又可标记RNA。
PI 不能进入完整的细胞膜，常用于检测膜损伤、细胞凋亡、细胞核定位、核酸定量等。激发波长493nm，发射波长630nm。
AO 激发波长为492nm，发射波分别为530/ 640 nm。用激光共聚焦显微镜双通道观察可见：活细胞的胞核呈黄绿色荧光，胞质呈绿色荧光;死细胞呈红色荧光。(AO 与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式2 种，强结合方式又称插入性方式，主要与DNA 结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光;弱结合方式即静电吸引结合方式，主要与 RNA 分子结合，其发射峰为640nm，呈红色荧光) Hoechst33342、Hoechst33258 和DAPI，这3 种都是DNA 的特异性的荧光染料，细胞毒性小特异性强。与DNA 结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，分辨率高。激发波长343/345nm，发射波长480/455nm。
3.4 蛋白质、酶、抗体及其他分子等的检测 FITC(异硫氰酸荧光素)能够结合细胞内总蛋白质，它是检测蛋白质最常用的荧光探针，它还能广泛地结合各种特异性的配体。用488nm 的激光器激发后，发出明亮的绿色荧光。光照下易淬灭，不易保存。
另一种常用的共价标记物是罗丹明，其光稳定性比FITC 好。其衍生物TRITC(四甲基异硫氰基罗丹明)是常用的共价标记探针，发红色荧光。绿色荧光蛋白(GFP)已成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物。该蛋白吸收光的波长最高峰在395nm 处，在479nm 处也有吸收峰;发射的绿色荧光波长最高峰在509nm 处，在540nm 处伴随有一小峰。因此内源性荧光基团受到紫外光或蓝光激发时，均可发出绿色荧光。类似于绿色荧光蛋白，目前所使用的荧光蛋白还包括蓝色荧光蛋白 (BFP)，青色荧光蛋白(CFP)及黄色荧光蛋白(YFP)。
3.5 膜电位
利用荧光探针在细胞膜内外的分布差异测出膜电位。根据膜电位荧光探针对膜电位变化反应速度的快慢分为：快反应探针：Di-8-ANEPPS、Di-4- ANEPPS;慢反应探针：JC1 为线粒体膜电位荧光指示剂。
3.6 pH 值
测量细胞内pH 值常用的荧光探针有BCECF 和6-COFDA，这2 种pH 荧光探针都是荧光素的衍生物;还有SNARF 系列以及DCH 等pH 指示剂。
3.7 细胞内活性氧基
常用DCFH-DA 直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化。
3.8 细胞间通讯
Confocal 可用荧光光漂白恢复(FRAP)技术检测细胞缝隙连接通讯，该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去发光能力，而临近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到已被漂白的细胞中，荧光可以逐渐恢复。由于光漂白过程是不可逆的，因此可通过观察已发生荧光漂白细胞其荧光恢复过程的变化量来判断细胞缝隙连接的通讯功能。常用的荧光探针是：6- 羧基荧光乙酰乙酸、CFDA、FITC。
3.9 荧光能力共振转移
常用的特定荧光对有：CFP 和YFP、BFP 和 GFP(CFP、BFP 的激发波长分别与YFP 和GFP 的发射波长相重叠)，cy3/cy5,FITC/TRITC。
3.10 细胞结构
常用的标记线粒体的荧光探针：JC-1、Rhodamine123 、SPMI ;标记高尔基复合体：NBD ceramide 、BODIPY ceramide ;标记内质网：Dioc6 ;标记溶酶体：DAMP、neutral red。

4 样品要求

样品经荧光探针标记( 单标、双标、三标)。固定的或活的组织。固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上。悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。载玻片厚度应在0.8 ～ 1.2mm 之间，盖玻片应光洁，厚度在 0.17mm 左右。标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发。尽量去除非特异性荧光信号。封片剂多用甘油：PBS 混合液(9 ∶ 1)，甘油还有抗荧光淬灭的作用。

5 样品观察的一般步骤及参数选择

根据荧光探针的激发波长和发射波长，选择合适的激发波长，分光镜滤片和发射滤片。确定扫描方式：点、线、面、三维扫描( Xt、Yt、Zt XY、XZ、XYt、XZt、XYZ、XYZt)。确定扫描密度(分辨率)：256×256、512×512、1024×1024、 2048×2048。选取物镜的倍数及电子放大倍数：这个条件被确定后，扫描范围即被确定，物镜的光透射率与数值孔径(NA)的4 次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此，应尽量选择高数值孔径的物镜。根据样品的制备质量选择合适的针孔大小，若针孔的大小以Ariy Disk 为单位，通常将针孔设为1，如果样品的荧光标记非常弱，可适当将针孔调大。确定光切范围，即扫描样品的厚度，锁定起始位置和结束位置。给出光切的层数及取图时累计平均次数。
3.1定量荧光测量

　　ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
　　
3.2定量共聚焦图像分析
　　借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。
　　
3.3三维重组分析生物结构
　　ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。
　　
3.4动态荧光测定
　　Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如 Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。
　　
3.5荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数
　　荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。
　　
3.6胞间通讯研究
　　动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。
　　
3.7细胞膜流动性测定
　　ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。
　　
3.8笼锁―解笼锁测定
　　许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。
　　
3.9粘附细胞分选
　　 ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是 Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。

3.10细胞激光显微外科及光陷阱技术
　　借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。
　
4、结语
　　激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。