经验分享：循环外泌体PD
癌症治疗中最成功的创新之一是使用检查点抑制剂药物，这些药物旨在阻止癌细胞抑制免疫系统。这类药物的主要靶标之一是序性死亡配体1（PD-L1），一种T细胞表面的蛋白质。外泌体PD-L1在恶性肿瘤免疫治疗领应用前景广阔，已成为外泌体领域研究的热点之一。
相比检测组织PD-L1表达，循环外泌体PD-L1检测更易于获取标本和开展实时检测，同时可避免病理取材带来的组织异质性问题；外泌体PD-L1也是导致肿瘤免疫逃逸的重要原因，且与恶性肿瘤进展相关，有可能成为病情评估及预后预测的重要指标。
目前循环外泌体PD-L1检测仍缺乏公认有效的手段，有待建立分离方式简单或不需分离、样本需求量少、高灵敏度、重复性好、检测信号不易受干扰的理想循环外泌体PD-L1检测方法。常用语检测循环外泌体PD-L1的方法主要有：
一、数字PCR技术由于外泌体所含核酸量较少，因此常规检测方法难以对其基因拷贝数进行准确检测。数字PCR技术是一种具有极高灵敏度且可以绝对定量的核酸检测方法，其灵敏度可达单个核酸分子级别，因此在检测外泌体核酸含量方面具有优势。研究者利用数字PCR技术对黑色素瘤及非小细胞肺癌患者血浆外泌体中PD-L1 mRNA 拷贝数进行了精确定量分析，并据此揭示了血浆外泌体PD-L1 mRNA拷贝数与抗PD1治疗效果间的相关性。数字PCR技术的引入显著提高了外泌体PD-L1 mRNA的检测能力，对外泌体PD-L1研究具有重要意义。但外泌体PD-L1 mRNA含量与PD-L1蛋白表达量间可能存在非一致性，因此单纯检测外泌体PD-L1 mRNA可能存在一定缺陷，需进一步研究阐明。
二、酶联免疫法（ELISA）法ELISA是传统的免疫学分析方法，常用于检测血浆或培养基中的小分子蛋白，具有较高的灵敏度且可进行定量分析。ELISA也可用于检测外泌体PD-L1蛋白，且可实现对大批量样本的定量检测。基于ELISA法原理的PD-L1蛋白检测试剂盒也被应用于血浆外泌体PD-L1蛋白定量检测中。CHEN等基于ELISA法原理构建了外泌体PD-L1蛋白检测体系，用于细胞培养基或血浆来源外泌体PD-L1蛋白检测，其线性检测范围为0.2~12.0 ng/mL。ELISA法是一种较好的外泌体PD-L1蛋白检测方法，易于定量检测、重复性好，但是由于血浆中亦存在游离的PD-L1蛋白，会干扰其准确性，因此该方法检测循环外泌体PD-L1蛋白的灵敏度与特异度仍需进一步探究。
三、流式分析法流式分析法常用于对悬浮于液体中的细胞或其他生物颗粒进行分型及计数，因此该法亦被引入到外泌体检测及计数中。THEODORAKI 等首先使用层析法对头颈癌患者血浆中的外泌体进行初步分离，然后采用流式分析法对PD-L1阳性的外泌体进行检测并计数，PD-L1蛋白表达量以荧光强度表示，结果显示该方法在检测外泌体PD-L1蛋白时具有很好的重复性，对单个患者样本进行多次平行测定时，其个体内变异为7%。同时，为验证该方法的准确性，研究者以共聚焦荧光分析法作为外泌体PD-L1蛋白检测的参考方法，使用流式分析法与共聚焦荧光分析法对低值、中值、高值3例样本进行平行检测，并将结果进行比较，发现流式分析法结果与共聚焦荧光分析法结果具有较高的一致性，说明流式分析法是准确的外泌体PD-L1定量分析方法。此外，LUX等也成功利用流式分析法检测了胰腺癌患者血清中的外泌体PD-L1和c-Met蛋白表达量，但检测方法性能有待进一步研究。目前专门用于外泌体检测的流式分析仪也已上市，如Apogee超灵敏纳米流式分析仪等，相比传统流式分析仪更适合用于外泌体蛋白检测。
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