一类含脂肪氨基的吲哚

作者：杨超月

一类含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物的合成及应用
技术领域
1.本发明涉及生物有机合成领域中的一类含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物的合成及应用。

背景技术：

2.在癌症治疗领域，肿瘤细胞具有转移性、侵袭性、无限增殖的特点，常规药物治疗选择性低，在抑制肿瘤细胞生长的同时也严重损伤正常细胞，伴有严重的副作用。因此，针对特定生物靶点的高特异性靶向抗肿瘤治疗引起了人们的极大关注，脱氧核糖核酸(dna)是人体内一类重要的遗传物质，被认为是开发新的抗癌药物的重要生物靶点之一。嵌入作用是抗癌药物与dna作用的重要模式，是指药物小分子平面稠环部分嵌插到dna两个堆积的碱基对中。其中，小分子的平面发色团部分必须至少具有的表面积，即3～4个芳香环结构。dna与小分子嵌入剂结合引起dna构象改变，使其不能或不易复制、转录，从而显现出抗肿瘤、抗病毒的活性。经典的dna嵌入剂如萘酰亚胺作为潜在的抗癌药物已被广泛研究，其中如阿莫那菲、米托那菲等均已进入临床试验，但由于其在临床研究中表现出非常严重的中枢神经系统毒性(cns)及骨髓抑制，目前已止步于ⅲ期临床。
3.具有吲哚环结构的靛红衍生物(isatin，吲哚-2,3-二酮)，可以与不同治疗靶点通过形成氢键、π-π共轭、金属螯合作用多种非共价键作用而结合。芳环上强吸电子基团双氰基的引入，可以抑制氧化代谢，提高化合物在体内代谢的稳定性。体积较小的氰基可以深入到靶标深处，增强药物小分子与靶标的相互作用，提高药效。因此含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物的合成及应用具有重要的研究意义和应用价值。

技术实现要素：

4.本发明提供一类含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物的合成及应用。目的在于通过扩大靛红母体的共轭环结构，将双氰基和柔性侧链引入到靛红结构中，在保留靛红分子本身的作用靶点的同时，增加其嵌入dna的能力，以期得到抗肿瘤活性更好的化合物。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一类含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物，其化学分子结构通式如下：
[0006][0007]
本发明所述的含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物，以苯胺为起始原料与水合氯醛和盐酸羟胺反应生成2-(羟乙胺)-n-苯乙酰胺，在酸性条件下环化、水解得到吲哚-2,3-二酮(靛红)，接着将靛红与1,2-二溴乙烷进行取代反应得到中间体1-(2-溴乙基)二氢吲哚-2,3-二酮，再以该中间体与2,3-二氨基顺丁烯二腈发生单缩合反应得到中间体2-氨基-3-(((z)-1-(2-溴乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)氨基)马来腈。上述中间体进一步环化并与不同脂肪胺进行取代反应得到含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物。
[0008]
所述脂肪胺包括二甲胺基、吗啉基、硫代吗啉基、二乙胺基、n-甲基哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、吡咯基、咪唑基和哌嗪基。
[0009]
上述的含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈抗肿瘤化合物的合成路线如下：
[0010][0011]
本发明提供上述的含脂肪氨基的吲哚-2,3-二腈类衍生物在在肿瘤细胞的生长抑制及正常免疫细胞中的应用。所述细胞包括4t1(小鼠乳腺癌细胞)、ct26(小鼠结肠癌细胞)、b16f10(小鼠黑色素瘤高转移细胞)和raw264.7(小鼠免疫细胞)。结果表明，该类化合物对小鼠乳腺癌、小鼠结肠癌、小鼠黑色素瘤高转移等癌细胞均有明显的抑制活性。此外，化合物ⅳc、ⅳf对小鼠免疫细胞raw264.7没有毒性，具有生物安全性，而阳性对照药5-氟尿嘧啶表现出了明显的毒性。
[0012]
采用噻唑蓝(mtt)法测定该类化合物和阳性对照药5-氟尿嘧啶对4t1(小鼠乳腺癌细胞)、ct26(小鼠结肠癌细胞)、b16f10(小鼠黑色素瘤高转移细胞)和raw264.7(小鼠免疫
细胞)的细胞毒性ic
50
。使用96孔板接种细胞，用培养液稀释细胞悬浮液至细胞数量为8000个/孔，孵育12h后每孔加入100μl梯度浓度药液，设置空白对照；在恒温培养箱中孵育24h。每孔加入5mg/ml的mtt溶液，避光孵育4h后取出。吸去上清液，每孔加入dmso溶解甲瓒结晶，用酶标仪测试在570nm处的吸光值(od)。
附图说明
[0013]
图1为化合物ⅳa～ⅳf与ct-dna作用的圆二色光谱图；
[0014]
图2为不同浓度的ⅳc滴定ct-dna的圆二色光谱图；
[0015]
图3为化合物ⅳc和ⅳf对ct-dna的相对粘度的影响。
具体实施方式
[0016]
下面通过实施例对本发明做进一步的说明。
[0017]
实施例1
[0018]
化合物ⅳa的合成：
[0019]
(1)中间体12-(羟乙胺)-n-苯乙酰胺的合成：
[0020][0021]
将水合氯醛(24.81g，0.15mol)溶于350ml水中，分批加入无水硫酸钠(113.6g，0.8mol)，搅拌至溶解完全。苯胺(9.31g，0.1mol)溶于100ml水中，向苯胺溶液中缓慢滴加浓盐酸(25ml，0.3mol)，充分搅拌。将搅拌均匀的溶液混合后，再将盐酸羟胺(31.27g，0.45mol)溶于50ml水中，缓慢滴加到反应液中，将反应液加热至回流，反应2h，冷却至室温，抽滤，固体干燥后用乙酸乙酯重结晶，得到13.5g黄色固体，产率82％。
[0022]
(2)中间体吲哚-2,3-二酮(靛红)的合成：
[0023][0024]
在150ml三颈烧瓶中加入65ml浓硫酸，将13g2-(羟乙胺)-n-苯乙酰胺分批加入到浓硫酸中，升温至50℃，充分搅拌，使反应温度保持在75℃以下，30min后升温至80℃反应30min，冷却至室温，倾倒至1000ml冰水中，迅速搅拌后有大量固体析出，抽滤，干燥，将所得粗品溶于50℃的氢氧化钠溶液中，搅拌2h后将少量不溶物过滤除去，所得滤液在0℃下滴加盐酸至ph＝1，搅拌1h后抽滤，干燥，得到9.3g橘红色固体粉末，产率80％。
[0025]
(3)中间体1-(2-溴乙基)二氢吲哚-2,3-二酮的合成：
[0026][0027]
将靛红(7.36g，0.05mol)溶于20ml无水dmf中，加入无水碳酸钾(13.82g，0.1mol)，充分搅拌后逐滴加入1,2-二溴乙烷(4.31ml，0.05mol)，混合物在室温条件下反应24h，反应
结束后，将反应液倒入100ml冰水中，静置析出大量固体，减压过滤，粗产物经过柱层析提纯，洗脱条件为v(乙酸乙酯):v(石油醚)＝1：3，得到橘红色针状晶体8.6g，产率68％。
[0028]
(4)中间体2-氨基-3-(((z)-1-(2-溴乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)氨基)马来腈的合成：
[0029][0030]
将中间体1-(2-溴乙基)二氢吲哚-2,3-二酮(379.46mg，1.5mmol)溶于6ml无水乙醇，搅拌10min至完全溶解，加入2,3-二氨基顺丁烯二腈(162.06mg，1.5mmol)，滴加三滴冰乙酸，反应液回流，tlc跟踪至反应结束，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱条件为v(乙酸乙酯):v(石油醚)＝1.5：1，得到红色粉末状固体344.7mg，产率：67％。
[0031]1hnmr(600mhz,dmso)δ：8.58(s,2h),7.78(d,j＝7.4hz,1h),7.47(t,j＝7.5hz,1h),7.22(d,j＝8.3hz,1h),7.12(t,j＝7.7hz,1h),4.16(t,j＝6.3hz,2h),3.76(t,j＝6.3hz,2h).
[0032]
(5)化合物ⅳa的合成：
[0033][0034]
向25ml反应瓶中加入12ml无水dmf，搅拌下将中间体2-氨基-3-(((z)-1-(2-溴乙基)-2-氧代吲哚啉-3-亚基)氨基)马来腈(514.52mg，1.5mmol)，无水碳酸钾(414.63mg，3mmol)加入，搅拌20min后，加入二甲胺40％水溶液(0.6ml，9mmol)，室温反应24h，在减压条件下除去溶剂，硅胶柱层析分离，洗脱条件为v(乙酸乙酯):v(二氯甲烷)＝1：5，得148.1mg橘黄色固体，产率34％，m.p.＝205.3～206.0℃。
[0035]
hr-ms,m/z:c
16h14
n6,[m+h]
+
计算值：291.1280,实测值：291.1348。
[0036]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:8.44(d,j＝7.8hz,1h),7.85(t,j＝7.5hz,1h),7.65(d,j＝8.3hz,1h),7.55(t,j＝7.5hz,1h),4.60(t,j＝6.5hz,2h),2.81(t,j＝6.5hz,2h),2.31(s,6h)；
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ:144.03,143.80,138.46,133.07,127.55,124.00,123.79,123.47,118.41,114.82,114.59,110.86,59.50,45.40,40.75.
[0037]
实施例2
[0038]
化合物ⅳb的合成：
[0039][0040]
制备方法参考实施例1，除用吗啉替代二甲胺之外，反应条件及提纯分离步骤相同，得淡黄色固体，产率36％，m.p.＝199.3～200.1℃。
[0041]
hr-ms,m/z:c
18h16
n6o,[m+h]
+
计算值：333.1386,实测值：333.1457。
[0042]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:8.45(d,j＝7.9hz,1h),7.86(t,j＝7.7hz,1h),7.65(d,j＝8.3hz,1h),7.56(t,j＝7.6hz,1h),4.62(t,j＝6.3hz,2h),3.57(t,j＝5.1hz,4h),2.84(t,j＝6.3hz,2h),2.54(t,j＝4.8hz,4h)；
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ:143.97,143.89,138.44,133.07,127.46,124.07,123.84,123.56,118.40,114.76,114.49,110.80,66.76,56.39,53.72,29.70.
[0043]
实施例3
[0044]
化合物ⅳc的合成：
[0045][0046]
制备方法参考实施例1，除用硫代吗啉替代二甲胺之外，反应条件及提纯分离步骤相同，得淡黄色固体，产率48％，m.p.＝203.1～203.9℃。
[0047]
hr-ms,m/z:c
18h16
n6s,[m+h]
+
计算值：349.1157,实测值：349.1223。
[0048]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:8.44(d,j＝7.7hz,1h),7.86(t,j＝7.4hz,1h),7.64(d,j＝8.3hz,1h),7.56(t,j＝7.5hz,1h),4.60(t,j＝6.2hz,2h),2.86(t,j＝6.2hz,2h),2.79(t,j＝4.8hz,4h),2.51(t,j＝4.4hz,4h)；
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ:144.01,143.85,138.40,133.07,127.46,124.02,123.80,123.55,118.23,114.77,114.40,110.85,56.61,55.22,39.98,27.90.
[0049]
实施例4
[0050]
化合物ⅳd的合成：
[0051][0052]
制备方法参考实施例1，除用二乙胺替代二甲胺之外，反应条件及提纯分离步骤相
同，得淡黄色固体，产率41％，m.p.＝201.6～203.3℃。
[0053]
hr-ms,m/z:c
18h18
n6,[m+h]
+
计算值：319.1593,实测值：319.1657。
[0054]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:8.42(d,j＝7.8hz,1h),7.84(t,j＝7.7hz,1h),7.66(d,j＝8.3hz,1h),7.54(t,j＝7.5hz,1h),4.57(t,j＝6.6hz,2h),2.89(t,j＝6.5hz,2h),2.54(q,j＝7.0hz,4h),0.85(t,j＝7.1hz,6h)；
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ:144.20,143.84,138.37,132.96,127.51,123.87,123.69,123.39,118.28,114.86,114.59,111.05,50.93,47.30,41.23,11.93.
[0055]
实施例5
[0056]
化合物ⅳe的合成：
[0057][0058]
制备方法参考实施例1，除用n-甲基哌嗪替代二甲胺之外，反应条件及提纯分离步骤相同，得黄色固体，产率44％，m.p.＝191.2～192.1℃。
[0059]
hr-ms,m/z:c
19h19
n7,[m+h]
+
计算值：346.1702,实测值：346.1775。
[0060]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:8.42(d,j＝7.8hz,1h),7.86(t,j＝7.7hz,1h),7.66(d,j＝8.3hz,1h),7.55(t,j＝7.5hz,1h),4.62(t,j＝6.3hz,2h),2.85(t,j＝6.4hz,2h),2.59(brs,4h),2.32(brs,4h),2.24(s,3h)；
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ:144.01,143.85,138.40,133.07,127.46,124.02,123.80,123.55,118.23,114.77,114.40,110.85,56.61,55.22,39.98,27.90.
[0061]
实施例6
[0062]
化合物ⅳf的合成：
[0063][0064]
制备方法参考实施例1，除用n-甲基哌嗪基替代二甲胺基之外，反应条件及提纯分离步骤相同，得淡黄色固体，产率45％，m.p.＝198.7～199.6℃。
[0065]
hr-ms,m/z:c
18h16
n6,[m+h]
+
计算值：317.1436,实测值：317.1505。
[0066]1hnmr(600mhz,cdcl3)δ:8.43(d,j＝7.9hz,1h),7.85(t,j＝7.8hz,1h),7.67(d,j＝8.3hz,1h),7.55(t,j＝7.6hz,1h),4.64(t,j＝6.9hz,2h),2.98(t,j＝6.8hz,2h),2.63(t,j＝6.5hz,4h),1.76(m,j＝6.8hz,4h)；
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ:144.06,143.72,138.46,133.08,127.51,123.96,123.75,123.47,118.36,114.83,114.57,110.90,54.35,53.90,41.74,23.58.
[0067]
本发明的抗肿瘤化合物与dna作用测试
[0068]
(1)抗肿瘤化合物ⅳa～ⅳf与小牛胸腺dna作用的圆二色光谱测试
[0069]
配制tris-hcl(20mmol，ph＝7.4)溶液。称取20mmol三羟甲基氨基甲烷(tris)，加入一定量超纯水溶解，冷却至室温后，在25℃恒温水浴槽中逐滴加入浓盐酸并不断搅拌，采用ph计测定其ph值。由于tris溶液的ph随温度变化差异较大，因此观察接近目标ph时，保持温度为25℃
±
2℃，直到ph＝7.4且不再变化为止，用500ml容量瓶定容，即得到浓度为20mmol，ph＝7.4的tris-hcl溶液。
[0070]
测试浓度：小牛胸腺dna(ct-dna)浓度为5.0
×
10-5
mol/l，化合物浓度为2.0
×
10-5
mol/l的tris-hcl溶液。称取适量小牛胸腺dna，加入1～2ml的tris-hcl溶液溶解，利用紫外分光光度计测试该溶液在260nm处的吸收值(a《1.0)，并根据朗伯-比尔a＝εbc计算出该dna溶液的浓度，根据计算得到的溶液浓度进行适当稀释得到浓度为1.0
×
10-3
mol/l的dna-tris-hcl溶液作为备用溶液。再分别精确称取1.0
×
10-2
mmol制备的抗肿瘤化合物于10ml容量瓶中，用dmso定容，得到浓度为1.0
×
10-3
mol/l的化合物溶液作为备用溶液。分别取25μl dna-tris-hcl溶液、10μl化合物溶液和tris-hcl溶液配置成500μl的ct-dna化合物混合溶液，用于圆二色光谱测试。
[0071]
测试条件：在200-700nm之间扫描圆二色信号，速度500nm/min，响应速度0.5s，扫描循环次数2，步长1nm，谱带宽2nm，所有实验均在室温下使用石英比色皿进行。
[0072]
如图1所示，为化合物ⅳa～ⅳf与ct-dna作用的圆二色光谱图。25℃下在tris-hcl(ph＝7.4，20mmol/l)中ct-dna浓度为5.0
×
10-5
mol/l和加入化合物ⅳa～ⅳf浓度为2.0
×
10-5
mol/l作用的cd光谱
[0073]
考察了不同化合物ⅳa～ⅳf对dna的结合能力，由图1可见，在没有药物的情况下，ct-dna的cd光谱为典型的右旋b型，表现为由dna碱基对堆积形成276nm处的特征正峰和由dna双螺旋结构形成247nm处的特征负峰。在化合物ⅳa～ⅳf加入后，dna的正负峰信号均有明显的增加，表明化合物与dna以插层方式结合，这种嵌入作用增强dna碱基堆积并稳定螺旋度，从而使两个谱带强度明显增大。ⅳc与ⅳf在276nm处分别增至dna的1.60、1.59倍，说明ⅳc的嵌入能力大于ⅳf。
[0074]
(2)不同浓度的ⅳc滴定小牛胸腺dna的圆二色光谱测试。
[0075]
测试浓度：固定dna的浓度为1.0
×
10-4
mol/l，配制不同浓度的化合物ⅳc与dna的混合溶液，化合物与dna的混合溶液浓度比值r分别为0.05，0.10，0.15，0.20。
[0076]
测试条件：在200-700nm之间扫描圆二色信号，速度500nm/min，响应速度0.5s，扫描循环次数2，步长1nm，谱带宽2nm，所有实验均在室温下使用石英比色皿进行。
[0077]
如图2所示，为不同浓度化合物ⅳc滴定ct-dna的圆二色光谱图。25℃下在tris-hcl(ph＝7.4，20mmol/l)中ct-dna浓度为1.0
×
10-4
mol/l，化合物ⅳc与dna的浓度比值r分别为0，0.05，0.10，0.15，0.20的cd光谱
[0078]
为了深入了解化合物与dna相互作用模式，我们进一步选择化合物ⅳc进行了圆二色滴定实验如图2，随着ⅳc浓度的增大，dna的cd正峰不断增大，最大正峰为初始dna的1.46倍，而dna的cd负峰呈现微小的减弱趋势且无明显的红移，说明化合物ⅳc引起dna构象由b型向a型(a-like)转变，这是一种经典的dna嵌入剂引起的cd信号变化。
[0079]
(3)化合物ⅳc、ⅳf与dna作用的粘度测试。
[0080]
采用乌氏粘度计在恒温水浴槽(25℃)中进行粘度测定。移取体积为15ml的ct-dna溶液(c
dna
＝100μm)加入到粘度计中，用秒表记录液面流下经过两个刻度线之间的时间。向15ml溶液中依照r值不断滴加化合物浓度为1.0
×
10-3
m的dmso溶液。每次滴加完化合物，用吸耳球鼓泡以混合均匀。记录混合溶液滴下的时间，不同r值时的溶液滴下时间重复测量三次，每次时间相差不得超过0.2秒，三次时间取平均值。
[0081]
以(η/η0)
1/3
相对于r值作图，其中η表示加入化合物后的dna的相对运动粘度，η0表示没有化合物时的dna的相对运动粘度。r值依次为：0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18，0.21，0.24。
[0082]
如图3所示，化合物ⅳc和ⅳf对ct-dna的相对粘度的影响。25℃下在tris-hcl(ph＝7.4，20mmol/l)中随着化合物ⅳc、ⅳf(化合物与dna的浓度比值r分别为0.03，0.06，0.09，0.12，0.15，0.18，0.21，0.24)的加入，浓度为1.0
×
10-4
mol/l的dna相对粘度变化
[0083]
粘度增大是靶向小分子与dna发生嵌插作用的主要标志之一。如图3所示，化合物ⅳc、ⅳf的加入都会使dna粘度增大，表明化合物以嵌插方式与dna结合，分子嵌插到碱基对中使碱基对分离，dna链发生解旋增长，引起溶液粘度增加。而当靶向小分子以静电吸引或沟槽结合方式与dna作用时，dna链的长度则不会发生变化，溶液粘度亦几乎无变化。从粘度变化的趋势来看，使dna双螺旋变长的能力顺序为ⅳc》ⅳf，说明化合物ⅳc具有更高的dna损伤能力。
[0084]
应用例1：体外抗肿瘤测试
[0085]
采用mtt法测定化合物ⅳa～ⅳf的对于不同类型细胞系的体外抗肿瘤活性。mtt是一种黄色粉末状化学试剂，全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。mtt比色法是指与药物作用后未被杀死的细胞的线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将外源性的mtt还原为蓝紫色的甲瓒结晶(formazan)，而死细胞由于自身细胞结构的破坏并不能发生上述过程。甲瓒结晶可以溶于sds、二甲基亚砜和酸性异丙醇等有机溶剂中，通过使用酶联免疫检测仪测定在570nm处的光吸收值，从而间接反应活细胞的数量。在一定范围内，光吸收值越小，则表明活细胞数量越少，药物的抑制增殖效果越好。
[0086]
本实验选用4t1(小鼠乳腺癌细胞)、ct26(小鼠结肠癌细胞)和b16f10(小鼠黑色素瘤高转移细胞)三种肿瘤细胞系和raw264.7(小鼠免疫细胞)正常细胞系对化合物ⅳa～ⅳf进行体外抗肿瘤测试。实验步骤如下：
[0087]
(1)复苏后的细胞加入适量培养液进行传代培养，待细胞处于对数生长期时加入2ml胰蛋白酶润洗、消化，使用96孔板接种细胞，用培养液稀释细胞悬浮液至细胞数量为8000个/孔，在37℃，5％的co2的恒温培养箱中孵育12h。
[0088]
(2)配置浓度为100mmol/l的化合物dmso溶液作为母液，依次将药物浓度稀释为0μmol/l、0.01μmol/l、0.1μmol/l、1μmol/l、10μmol/l、100μmol/l、200μmol/l七个梯度(每个药物浓度梯度设置4个复孔以减少实验误差)，每孔加入100μl含药培养基，设置空白对照(用等量的培养液代替药物，其他条件保持一致)，继续放置在37℃，5％的co2恒温培养箱中孵育24h。
[0089]
(3)用pbs缓冲溶液将适量mtt配置成5mg/ml的溶液，每孔加入20μlmtt溶液，避光孵育4h后取出。轻轻吸去上清液，每孔加入100μl dmso溶解甲瓒结晶，待结晶完全溶解后，用酶标仪测试在570nm处的吸光值(od)，根据式(1)计算肿瘤细胞生长抑制率。之后，根据
graphpadprism8.0及ibm spss计算得出化合物的ic
50
。
[0090]
肿瘤细胞生长抑制率＝1-(od
exp-od
blank
)/(od
con-od
blank
)
×
100％(1)
[0091]
其中od
exp
表示实验组溶液的吸光度；od
con
表示对照组溶液的吸光度；od
blank
表示空白组溶液的吸光度。
[0092]
表1化合物ⅳa～ⅳf对不同细胞系的ic
50
值(μmol/l)
[0093][0094][0095]
以5-氟尿嘧啶作为阳性对照药，化合物ⅳa～ⅳf的细胞毒性ic
50
值如表1所示。由表1可知，化合物ⅳa、ⅳe对小鼠乳腺癌细胞4t1的ic
50
可以达到17.64和13.44μmol/l，对比对照药5-氟尿嘧啶(27.76μmol/l)有更优的抑制活性。化合物ⅳc、ⅳd对小鼠结肠癌细胞ct26的ic
50
可以达到8.23和8.54μmol/l，与对照药5-氟尿嘧啶(8.50μmol/l)相当；化合物ⅳd、ⅳe、ⅳf对小鼠黑色素瘤高转移细胞b16f10的ic
50
值分别为29.91、28.11、16.61μmol/l，其抑制活性显著优于对照药5-氟尿嘧啶(68.46μmol/l)。此外，为了评价化合物ⅳa～f的生物安全性，测试了其对小鼠免疫细胞raw264.7的抑制活性。结果表明，化合物ⅳc、ⅳf对小鼠免疫细胞raw264.7没有毒性(ic
50
》100μmol/l)，化合物ⅳa、ⅳb、ⅳd、ⅳe对raw264.7的毒性较小，分别为39.98、28.49、55.54、47.72μmol/l，而阳性对照药5-氟尿嘧啶却对正常细胞表现出严重的毒性(0.04μmol/l)。测试结果表明，连接硫代吗啉基的吲哚-2,3-二腈衍生物的抗肿瘤活性较好，且对小鼠免疫细胞raw264.7的ic
50
》100μmol/l，具有生物安全性。