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作者：张馨予

微流控芯片实验室在蛋白质研究中的应用（一）

随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代，在这个时期，最具有代表性的工作是蛋白质组学研究。蛋白质是生理功能的执行者，也是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于对蛋白质的直接研究来解决。

蛋白质是由约二十种氨基酸根据不同的排列顺序，以肽键的形式（-CO-NH-）结合而成的具有一定空间结构的链状化合物，蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究就技术而言远要比核酸研究复杂和困难得多，因此对研究平台提出了更高的要求。迄今为止，还没有一种研究手段可以解决蛋白质研究的所有问题。

目前，蛋白质研究中采用最为普遍的技术是二维凝胶电泳，通常包括以下几个步骤：1、从细胞提取一组蛋白质；2、通过二维凝胶电泳分离；3、剪切并消化凝胶蛋白斑点；4、通过质谱分析消化后产生的多肽混合物；5、把由此得到的蛋白质谱图和已有的数据库中的蛋白质数据进行比对。但是，该研究方法的整个操作过程繁琐费力，存在着诸多局限性。为了使蛋白质研究更快捷有效，必须寻找新的具有高通量、高准确性、高灵敏度的研究手段。

在过去的十几年中，微流控芯片技术得到快速发展，微流控芯片作为蛋白质研究平台的优越性日益明显。微流控芯片在蛋白质研究中的应用可以用图11-1所示框图概括，在下面各节中，将对其中的各个方面予以较为详细的阐述。

图11-1 微流控芯片蛋白质研究整体框图

11.1 微流控芯片蛋白质分析技术

微流控芯片实验室具有各种操作单元灵活组合、规模集成的特点，传统分析方法难以比拟，很能符合蛋白质组学研究发展的需要[1]。目前，有关蛋白质分析的各种单元技术，包括样品预处理、分离和检测等都已经在微流控芯片上实现。相关的检测技术在前面章节已有具体阐述，在此不再赘述，下面仅对微流控芯片上的蛋白质样品预处理技术和分离技术作一详细介绍，着重关注其有别于其他类型样品的特殊性。

11.1.1 蛋白质样品预处理

样品的预处理是对样品进行分析或研究的重要环节，蛋白质的样品预处理是蛋白质能否被准确测定的一个关键步骤，目前主要涉及蛋白质样品的纯化、富集、衍生和酶解等几个方面。

11.1.1.1 蛋白质的纯化

样品纯化的主要目的是使主要组分同背景基质分离，减少背景杂质对分离或分析的影响。蛋白质样品的纯化主要是进行样品的脱盐处理，这在质谱检测中显得尤为重要，蛋白质样品中的盐类不仅影响离子化效果，还会造成质谱的污染。

① 微渗析

微渗析是根据分子对透析膜的选择性透过来实现的一种蛋白质脱盐方法。图11-2（a）为蛋白质纯化用双层微渗析微流控芯片[2]，即在三层流体通道间加入了两片截留分子量不同的透析膜（见图11-2（b）），上层通道内的蛋白质样品先经过高截留的膜进入中间通道与基质分离，而进入中间层的样品与下层溶液呈逆向流动，其中的盐分和其他小分子干扰物透过低截留的膜进入下层而被除去。将该芯片用于大肠杆菌裂解液中的蛋白质分析，通过两次微渗析后质谱峰的信噪比提高了约20倍。

图11-2 双层微渗析微流控芯片[2]

(a) 芯片实物图；(b) 芯片结构组成示意图

② 液－液萃取

液－液萃取是根据样品中蛋白质和杂质小分子扩散系数不同而实现的一种蛋白质脱盐纯化方法。液－液萃取操作相对简单，芯片微通道中流体的层流状态尤其为液－液萃取提供了便利条件，大大加快了蛋白质样品脱盐的速度。图11-3（a）为具有四个出口的矩形微通道构成的液－液萃取芯片[3]，样品蛋白质溶液和脱盐缓冲液分别从不同的入

口中注入，通过压力驱动使两种溶液在芯片通道内形成层流，根据样品溶液中蛋白质与盐类小分子对该缓冲液的扩散系数不同，进行扩散脱盐，脱盐的蛋白质在目标分析物出口处被收集后，可进行后续的质谱分析，而大多数盐则随着缓冲液进入废液池中，60 ms内就可以实现蛋白质样品的纯化。脱盐后的质谱结果与非脱盐结果比较，信号明显增强，见图11-3（b）。

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